馬杜霉素免疫學(xué)快速檢測方法的研究.pdf

1、馬杜霉素（Maduramicin，MD)又名馬杜米星，是在1983年由Liu和Labeda在微生物Actinomadurayumaensis的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的聚醚類離子載體抗生素的一種。馬杜霉素對動物的球蟲病具有用藥量小、見效快和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，被廣泛添加在畜禽飼料中。然而，這會造成馬杜霉素在動物機體內(nèi)殘留、蓄積，食用這些動物組織可引起血管舒張，特別是誘發(fā)心臟冠狀動脈擴張，引起患有冠狀動脈疾病的人群的冠狀動脈擴張，使病情惡化，

2、很大程度上危害著人類的健康。隨著科學(xué)技術(shù)的日益發(fā)展，新的、更高效的檢測技術(shù)也在不斷的被開發(fā)應(yīng)用。目前已有微生物學(xué)檢測方法、紫外分光光度計法、薄層色譜法、高效液相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)以及免疫學(xué)檢測方法等。建立一種準(zhǔn)確、快速、有效的檢測食品中馬杜霉素殘留的分析方法，對于食品安全具有很大的實際意義。本研究在分析、制備馬杜霉素人工抗原的基礎(chǔ)上，運用單克隆抗體技術(shù)制備出馬杜霉素單克隆抗體，組裝馬杜霉素ELISA試劑盒，并對其試劑盒的性能進(jìn)行了評

3、價，為馬杜霉素的快速檢測試劑盒的應(yīng)用及推廣打下了基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴用混合酸酐法將馬杜霉素與牛血清蛋白（BSA）、雞卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)，合成人工免疫原 MD-BSA和包被抗原 MD-OVA，通過紫外分光光度計法（UV）、凝膠電泳（SDS-PAGE）和免疫小鼠獲得的多抗血清的 ELISA鑒定，表明MD-BSA偶聯(lián)成功，獲得效價和敏感良好的的多克隆抗體。⑵用ELISA方法選擇細(xì)胞融合用鼠，運用雜交瘤技術(shù)將免疫小鼠脾細(xì)

4、胞與NS0瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)檢測、篩選、克隆化后，獲得1D11、2F9、3A5、4H5、4D9五株特異、靈敏的雜交瘤細(xì)胞株，用4H5雜交瘤細(xì)胞株注射小鼠誘生腹水制備MD McAb，制備出的腹水經(jīng)鑒定親和力較良好，對馬杜霉素的IC50為1.455μg/L；與莫能菌素的交叉反應(yīng)率為6.19％，且與鑒定的其他同類藥物無交叉反應(yīng)。通過試驗獲得了高價、靈敏和特異的馬杜霉素單克隆抗體，可用于動物源食品中馬杜霉素的殘留的ELISA檢測試驗。⑶應(yīng)用

5、酶聯(lián)免疫吸附試驗系統(tǒng)的原理，用馬杜霉素單克隆抗體研制出馬杜霉素殘留快速檢測的 ELISA試劑盒（MD-Kit）。制備出的 MD-Kit標(biāo)準(zhǔn)曲線呈S型，線性關(guān)系良好，符合四參數(shù) Logistic曲線擬合，且效果良好；最低檢測限為0.186μg/L；半數(shù)抑制 IC50為0.175μg/L，變異系數(shù)小于<15%；對雞肝與雞肉分別添加5、10、100、200ng/ml MD標(biāo)準(zhǔn)品，平均回收率分別為71.225%和74.550%；MD-Kit性能