蒲黃總黃酮對(duì)C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖代謝的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　2型糖尿病、代謝綜合征等多種代謝性疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題之一，其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)和病理生理學(xué)基礎(chǔ)是胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)，而IR發(fā)生的重要機(jī)制是胰島素信號(hào)通路的障礙，因此，提高胰島素信號(hào)通路的活性是防治IR的重要策略。除了經(jīng)典的磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)胰島素信號(hào)通路外，近年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一條新的胰島素信號(hào)

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即β-arrestin 2依賴性信號(hào)通路。在胰島素刺激下，β-arrestin 2能募集Src和Akt到胰島素受體(Insulinreceptor，IR)，并結(jié)合形成一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)胰島素介導(dǎo)的葡萄糖代謝效應(yīng)。新的胰島素信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)將有助于進(jìn)一步理解IR，也為防治IR相關(guān)性疾病提供了新的作用靶點(diǎn)。目前改善IR的代表藥物是噻唑烷二酮類(Thiazolidinediones，TZD)藥物，其作用機(jī)制是激動(dòng)過氧化物酶增殖

3、活化受體-γ，提高PI3K信號(hào)通路的活性。盡管TZD已廣泛用于IR相關(guān)性疾病的防治，但也出現(xiàn)了一些副作用，如引起水鈉儲(chǔ)留，增加體重和體脂，并增加2型糖尿病患者心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)，包括致死性心血管事件的發(fā)生。因此，尋找一種既能提高胰島素敏感性又不至于引起脂肪堆積，不增加心血管事件等不良反應(yīng)的胰島素增敏劑是目前研究的一個(gè)重要方向。近年在臨床上，傳統(tǒng)的一種活血化瘀中藥--蒲黃常用于治療伴IR的2型糖尿病、代謝綜合征、肥胖等。在體外實(shí)驗(yàn)中，課題組

4、前期工作發(fā)現(xiàn)蒲黃有效提取物蒲黃總黃酮(Pollen Typhae total flavones，PTF)能增加3T3L-1脂肪細(xì)胞依賴于胰島素的葡萄糖攝取和利用，減少脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集，具有改善IR的潛在能力，但PTF缺乏系統(tǒng)的研究，其潛在分子機(jī)制也不清楚。
　　目的：
　　1.觀察PTF對(duì)C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝取的影響，并了解這種效應(yīng)與胰島素的關(guān)系；
　　2.觀察PTF對(duì)高濃度棕櫚酸和高糖高胰島素誘

5、導(dǎo)的IR模型細(xì)胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝取的影響；
　　3.從蛋白水平觀察PTF對(duì)PI3K信號(hào)通路和β-arrestin2依賴性信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子蛋白表達(dá)的影響，探討PTF提高胰島素敏感性的分子機(jī)制；
　　4.從基因水平觀察PTF對(duì)β-arrestin2依賴性信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子基因mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討PTF提高胰島素敏感性的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.二甲氧唑黃(XTT)比色法觀察PTF對(duì)C2C12

6、骨骼肌細(xì)胞活力的影響；
　　2.分別采用葡萄糖氧化酶法和氚標(biāo)記的脫氧葡萄糖攝取法檢測(cè)C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝??；
　　3.模擬IR患者體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂及高血糖高胰島素水平的病理生理特點(diǎn)，以氚標(biāo)記的脫氧葡萄糖攝取試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，分別采用高濃度棕櫚酸和高糖高胰島素孵育誘導(dǎo)C2C12骨骼肌細(xì)胞，建立瓜細(xì)胞模型；
　　4.免疫印跡法(Western Blot)法檢測(cè)PI3K信號(hào)通路和β-arrestin2依賴性信號(hào)

7、通路相關(guān)信號(hào)分子蛋白表達(dá)及其磷酸化水平；
　　5.免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)法檢測(cè)β-arrestin2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的形成，并用WesternBlot法鑒定復(fù)合物中蛋白分子；
　　6.ELISA法檢測(cè)PI3K活性；
　　7.Real-timePCR檢測(cè)基因β-arrestin2、Src和Akt2mRNA表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.PTF對(duì)C2C12骨骼肌細(xì)胞活力的影響

8、r>　　PTF干預(yù)C2C12骨骼肌細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞活性與PTF濃度呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)PTF濃度在0.05-1.0g/L之間時(shí)，與對(duì)照組比較，細(xì)胞的活性無明顯的改變(P>0.05)；而當(dāng)PTF濃度≥1.0g/L時(shí)，細(xì)胞的活性比對(duì)照組下降5.65％以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　2.PTF對(duì)C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗的影響
　　以不同濃度的PTF(0.1g/L，0.25g/L，0.5g/L)分別孵育C2C12骨骼肌

9、細(xì)胞8h、16h、24h，PTF呈胰島素依賴性促進(jìn)了C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗。PTF干預(yù)8h，只有0.5g/L濃度點(diǎn)PTF呈胰島素依賴性提高了細(xì)胞的葡萄糖消耗量，比胰島素處理組升高了10.63％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PTF干預(yù)16h，0.25g/L和0.5g/L濃度點(diǎn)PTF都能促進(jìn)細(xì)胞在胰島素處理下的葡萄糖消耗量，分別比胰島素處理組升高了10.62％和17.50％，差異明顯(P<0.05和P<0.01)；而干預(yù)24h

10、，3個(gè)濃度點(diǎn)PTF干預(yù)的細(xì)胞葡萄糖消耗量分別比胰島素處理組提高了11.60％，12.78％和16.23％，差異顯著(P<0.05、P<0.01和P<0.01)。
　　3.PTF對(duì)C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取的影響
　　以不同濃度的PTF(0.1g/L，0.25g/L，0.5g/L)分別孵育C2C12骨骼肌細(xì)胞8h、16h、24h，PTF呈胰島素依賴性促進(jìn)了C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取。PTF干預(yù)8h，只有0.5g/L濃度

11、點(diǎn)PTF呈胰島素依賴性提高了細(xì)胞的葡萄糖攝取量，比胰島素處理組升高了14.79％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PTF干預(yù)16h，0.25g/L和0.25g/L濃度點(diǎn)PTF都能促進(jìn)細(xì)胞在胰島素處理下的葡萄糖攝取量，分別比胰島素處理組升高了20.52％和34.84％，差異顯著(P<0.01和P<0.01)；而PTF干預(yù)24h，3個(gè)濃度點(diǎn)PTF干預(yù)的細(xì)胞葡萄糖攝取量分別比胰島素處理組提高了12.29％，23.40％和30.31％，差異明顯(

12、P<0.05、P<0.01和.P<0.01)。
　　4.Wortmannin及PP2對(duì)PTF促進(jìn)C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取的影響
　　與胰島素處理組相比，5uM PI3K特異性抑制劑wortmannin干預(yù)C2C12骨骼肌細(xì)胞16h，能明顯抑制胰島素處理下細(xì)胞的葡萄糖攝取量(P<0.01)，但不能抑制PTF呈胰島素依賴性促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取(P>0.05)；而5uM Src特異性阻斷劑PP2干預(yù)C2C12骨骼肌細(xì)胞16

13、h，也能顯著抑制胰島素處理下細(xì)胞的葡萄糖攝取量(P<4.01)，同時(shí)也明顯抑制PTF呈胰島素依賴性促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取(P<0.01)。
　　5.IR細(xì)胞模型的建立
　　與正常胰島素處理組比較，以0.5mM棕櫚酸孵育C2C12骨骼肌細(xì)胞16h，細(xì)胞對(duì)依賴于胰島素的葡萄糖消耗量和葡萄糖攝取量分明別下降了19.29％和22.22％，差異明顯(P<0.01和P<0.01)；而以高糖(25mM)高胰島素(1μM)孵育C2C12骨骼

14、肌細(xì)胞16h，細(xì)胞對(duì)依賴于胰島素的葡萄糖攝取量明顯低于低糖(5mM)低胰島素(1nM)組(P<0.01)。
　　6.PTF對(duì)IR模型細(xì)胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝取的影響
　　以0.5g/LPTF和棕櫚酸共同孵育C2C12骨骼肌細(xì)胞16h，與棕櫚酸誘導(dǎo)的IR細(xì)胞相比，該細(xì)胞對(duì)依賴于胰島素的葡萄糖消耗量和葡萄糖攝取量均得以顯著提高(P<4.01和.P<0.01)，與正常胰島素處理組相類似(P>0.05)；同樣，0.5g/LPTF與高

15、糖高胰島素共同孵育C2C12骨骼肌細(xì)胞16h，幾乎可以逆轉(zhuǎn)由高糖高胰島素所誘導(dǎo)的葡萄糖攝取量下降(P<4.01)。
　　7.PTF對(duì)胰島素信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子蛋白表達(dá)的影響
　　PTF干預(yù)C2C12骨骼肌細(xì)胞16h，能顯著提高細(xì)胞β-arrestin2、Src和Akt的蛋白表達(dá)，分別是對(duì)照組的1.65倍(P<0.01)、1.72倍(P<0.01)和1.24倍(P<0.05)，胰島素處理組的1.66倍(P<4.01)、1.67

16、倍(P<0.01)和1.49倍(P<0.01)；
　　PTF干預(yù)C2C12骨骼肌細(xì)胞16h，與胰島素處理組相比較，PTF能顯著提高胰島素刺激下InsRβ(Tyr1150/1151)、Src(Tyr416)、Akt(Thr308及Akt(Ser473)磷酸化水平(P<0.01)；
　　在胰島素刺激下，β-arrestin2募集Src、Akt并結(jié)合InsR形成一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物；PTF預(yù)先干預(yù)C2C12骨骼肌細(xì)胞16h，能顯著促進(jìn)

17、該信號(hào)復(fù)合物的形成；
　　PTF干預(yù)C2C12骨骼肌細(xì)胞16h，細(xì)胞PI3K-p85蛋白表達(dá)和PI3K活性分別是對(duì)照組的1.02倍和1.07倍，胰島素處理組的1.10倍和1.03倍，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　8.Wortmannin及PP2對(duì)PTF提高Akt磷酸化水平的影響
　　wortmannin干預(yù)C2C12骨骼肌細(xì)胞16h，能顯著抑制Akt(Thr308)和Akt(Ser473)磷酸化水平，分別比胰島

18、素處理組下降55.95％(P<0.01)和44.56％(P<0.01)；但PTF依賴于胰島素提高Akt(Thr308/Ser473)磷酸化水平的效應(yīng)不被wortmannin所抑制(P>0.05)；
　　同樣，PP2干預(yù)C2C12骨骼肌細(xì)胞16h，也能顯著抑制Akt(Thr308)和Akt(Ser473)磷酸化水平，分別比胰島素處理組下降51.18％(P<0.01)和46.83％(P<0.01)；而PTF依賴于胰島素提高Akt(Th

19、r308)和Akt(Ser473)磷酸化水平的效應(yīng)也被PP2所抑制，分別下降65.74％(P<0.01)和66.06％(P<0.01)。
　　9.PTF對(duì)胰島素信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子基因表達(dá)的影響
　　PTF孵育C2C12骨骼肌細(xì)胞16h，能明顯提高基因Src和Akt2mRNA的表達(dá)，分別是對(duì)照組的1.18倍(P<0.05)和1.26倍(P<0.01)，但PTF對(duì)基因β-arrestin2mRNA的表達(dá)無明顯影響(P>0.05

20、)。
　　結(jié)論：
　　1.PTF在不降低細(xì)胞活力的情況下，呈胰島素依賴性提高C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝取。
　　2.PTF呈胰島素依賴性促進(jìn)C2C12骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取受Sre阻斷劑PP2所抑制而不受PI3K抑制劑wortmannin所抑制。
　　3.高濃度棕櫚酸和高糖高胰島素都可以誘導(dǎo)C2C12骨骼肌細(xì)胞產(chǎn)生瓜。
　　4.PTF能夠逆轉(zhuǎn)分別由棕櫚酸、高糖高胰島素誘導(dǎo)C2C12骨骼肌細(xì)胞

21、所產(chǎn)生的IR。
　　5.PTF提高了C2C12骨骼肌細(xì)胞基因Src和Akt2mRNA的表達(dá)及β-arrestin2、Src和Akt蛋白表達(dá)。
　　6.PTF呈胰島素依賴性提高InsRβ(Tyr1150/1151)、Src(Tyr416)及Akt(Thr308/Ser473)磷酸化水平，并促進(jìn)β-arrestin2募集Src和Akt并結(jié)合InsR形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物。
　　7.PTF提高Akt(Thr308/Ser473)