內(nèi)源性硫化氫信號(hào)系統(tǒng)對(duì)輸精管舒縮活動(dòng)的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：本課題計(jì)劃研究輸精管內(nèi)源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)的表達(dá)、定位、功能及相應(yīng)的靶點(diǎn)。
　　 方法：人輸精管組織(vas deferens，VD)來(lái)自齊魯醫(yī)院左睪丸缺如的患者，住院號(hào)為(927100，788455，10016489)。大鼠及小鼠輸精管組織來(lái)自與成年雄性Wistar大鼠，體重為220±35g，成年雄性Balb/c小鼠30只，12小時(shí)光照/黑暗，室溫23℃～25℃，自由進(jìn)食進(jìn)水，動(dòng)物和標(biāo)準(zhǔn)

2、大鼠飼料均由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。利用Western blot，immunohistochemistry的方法研究大鼠、小鼠及人VDH2S的合成酶胱硫醚β-合成酶(cystathionine-β-synthetase，CBS)及胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)的表達(dá)及表達(dá)特征；利用亞甲基藍(lán)法檢測(cè)VD組織H2S的釋放；利用離體肌條灌流觀察張力變化的方法檢測(cè)內(nèi)源性及外源性H2S對(duì)VD舒縮活動(dòng)的影響；

3、在體實(shí)驗(yàn)采用精子計(jì)數(shù)的方法觀察NaHS對(duì)大鼠射精后輸精管殘留精子及受孕母鼠產(chǎn)仔率的影響，研究H2S對(duì)射精的影響。結(jié)果：大鼠、小鼠及人VD表達(dá)內(nèi)源性H2S的合成酶CBS及CSE，兩種酶在肌層及粘膜層均有表達(dá)。組織H2S釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠輸精管組織自發(fā)釋放H2S的速率約1nmol/mg tissue. min-1，加入H2S的前體左旋半胱氨酸(L-Cysteine，L-Cys)10mmol/L后H2S釋放可增加到5倍以上，而且該作用可被CSE

4、及CBS酶的抑制劑PAG和AOAA阻斷。輸精管離體肌條實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源性H2S的供體NaHS及內(nèi)源性H2S的前體L-Cys可濃度依賴性的舒張去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)誘導(dǎo)的輸精管平滑肌收縮，IC50分別是9.8±2.4μM和67.9±18.0μM。NaHS也可降低VD平滑肌自發(fā)性收縮的基礎(chǔ)張力，表明外源性H2S也可調(diào)節(jié)VD自發(fā)性收縮的基礎(chǔ)張力。H2S的前體L-Cys也可降低VD自發(fā)性收縮的基礎(chǔ)張力，而H2S的合成酶C

5、SE的抑制劑PAG增加基礎(chǔ)張力，CBS的激動(dòng)劑SAM可顯著性降低基礎(chǔ)張力，上述結(jié)果表明內(nèi)源性H2S可以調(diào)節(jié)輸精管平滑肌收縮的基礎(chǔ)張力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NaHS引起的舒張效應(yīng)不被KATP通道阻斷劑Gli、NOS合酶抑制劑L-NAME及TRP通道的阻斷劑2-APB、釕紅(Ruthenium Red，RR)或激動(dòng)劑辣椒素(capsaicin)所阻斷，而大電導(dǎo)鈣激活的鉀離子通道(large conductance calcium-activate

6、d potassium channels，BKCa)阻斷劑TEA及IBTX可明顯抑制NaHS的作用，表明H2S通過激活BKCa引起輸精管平滑肌舒張。我們進(jìn)一步觀察了還原劑DTT及巰基(-SH)保護(hù)劑NEM對(duì)NaHS引起的輸精管平滑肌舒張作用的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)還原劑DTT并不能改變NaHS的舒張作用，而巰基保護(hù)劑NEM卻明顯抑制NaHS的舒張作用，結(jié)果提示NaHS可能通過巰基-硫氫化過程(S-sulfhydration)硫化BKCa通道胞外

7、段游離的半胱氨酸殘基上的-SH，形成共價(jià)過硫化物(-SSH)，改變BKCa的空間構(gòu)象，增加鉀離子通透性，引起細(xì)胞膜電位超極化，導(dǎo)致平滑肌舒張。在體實(shí)驗(yàn)表明，在交配前雄鼠腹腔注射NaHS(28μmol·kg-1，ip)可顯著增加輸精管殘留精子數(shù)，減少受孕鼠的產(chǎn)仔數(shù)數(shù)量，表明H2S通過調(diào)節(jié)輸精管平滑肌的舒縮活動(dòng)影響射精過程。
　　 結(jié)論：CBS和CSE均功能性表達(dá)在大鼠、小鼠及人的VD，VD可合成并釋放H2S，表明VD存在內(nèi)源性H2