內(nèi)源性硫化氫在大鼠肝硬化不同時(shí)期的濃度變化及機(jī)制探討.pdf

1、目的： 本研究復(fù)制肝硬化早、中、晚期大鼠模型，通過(guò)測(cè)定H2S在門靜脈血及下腔靜脈血中的濃度，觀察肝組織中CBS和CSE蛋白、CBSmRNA和CSEmRNA的表達(dá)，分析內(nèi)源性H2S體系在肝硬化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中表達(dá)的變化，以探討H2S在肝硬化中的作用，進(jìn)一步為闡明肝硬化的發(fā)病機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法： 1.四氯化碳復(fù)合因素法建立肝硬化大鼠模型：40％四氯化碳棉籽油溶液給大鼠皮下注射，首次注射5ml/kg，

2、后每隔4天注射一次，每次3ml/kg，共注射12次，20％乙醇溶液作為唯一飲用液體，并給予高脂高膽固醇飼料。設(shè)立正常對(duì)照組大鼠，同期皮下注射生理鹽水，劑量同實(shí)驗(yàn)組，采用標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)方法。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中肝硬化形成經(jīng)驗(yàn)，在肝硬化發(fā)生過(guò)程的不同時(shí)期收集肝硬化大鼠標(biāo)本，即實(shí)驗(yàn)組大鼠分3批，每批27只，分別在實(shí)驗(yàn)的第15天、第30天、第52天將大鼠用乙醚麻醉，收集血漿及肝臟標(biāo)本，病理學(xué)確定肝硬化分期。 2.結(jié)果觀察：應(yīng)用蘇術(shù)素-伊紅染色觀察肝組

3、織病理形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)行肝硬化分期；測(cè)定門靜脈及下腔靜脈血漿H2S的含量；應(yīng)用免疫組化法觀察肝組織中CBS、CSE的表達(dá)，并用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)半定量檢測(cè)其蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱，灰階值越低說(shuō)明表達(dá)越強(qiáng)；采用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（RT-PCR）檢測(cè)CBS、CSE mRNA的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)GAPDH的表達(dá)作為內(nèi)參照，用凝膠成像分析系統(tǒng)半定量檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果以目的條帶與GAPDH光密度的比值表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量資料采用SPSS11.0軟件描述實(shí)

4、驗(yàn)數(shù)據(jù)特征，作單因素方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析，P<0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.肝硬化大鼠模型：根據(jù)病理學(xué)技術(shù)將大鼠分別確定為肝硬化早期組21只、中期組22只、晚期組20只、正常對(duì)照組10只。 2.血漿中H2S的檢測(cè)： 正常及肝硬化早、中、晚期大鼠門靜脈血中H2S濃度分別為369.73±43.39、276.29±24.64、182.82±36.08和131.94±23.67μmol

5、/L；肝硬化早期、中期和晚期大鼠門靜脈血中H2S濃度均顯著低于對(duì)照組。 正常及肝硬化早、中、晚期大鼠下腔靜脈血中H2S濃度分別為335.01±89.26、282.46±38.62、219.46±46.76和159.45±34.43μmol/L；與對(duì)照組大鼠比較，肝硬化早期、中期以及晚期大鼠的下腔靜脈血H2S均顯著降低。 各組大鼠門靜脈血與下腔靜脈血相比，正常對(duì)照組和肝硬化早期組H2S濃度相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在肝硬化中

6、期組與肝硬化晚期組，門靜脈血中H2S濃度明顯低于下腔靜脈，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.RT-PCR檢測(cè)CBS、CSEmRNA的表達(dá) 對(duì)照組、肝硬化早期、中期和晚期大鼠肝組織中CBSmRNA表達(dá)的R值分別為：0.47±0.09、0.58±0.13、0.71±0.20和0.89±0.09；CSEmRNA表達(dá)的R值分別是：0.80±0.08、0.99±0.23、1.16±0.20和1.41±0.29，說(shuō)明各組肝硬化大鼠的肝組織

7、中CBS、CSEmRNA的表達(dá)均明顯強(qiáng)于對(duì)照組。將同期肝組織中CBSmRNA和CSEmRNA的R值相比，CBSmRNA的表達(dá)均明顯低于CSEmRNA的表達(dá)。 4.免疫組化檢測(cè)CBS、CSE蛋白的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示肝硬化大鼠肝組織CBS、CSE的表達(dá)陽(yáng)性部位在胞漿。圖像分析結(jié)果顯示對(duì)照組、肝硬化早、中和晚期組的CBS灰階值分別為185.05±6.23、175.65±4.47、162.18±4.61和145.78±4.4

8、0；CSE灰階值分別為172.85±3.50、166.68±3.78、150.94±7.69和134.57±5.28，說(shuō)明各組肝硬化大鼠肝組織中CBS以及CSE的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組。將同期肝組織中CBS和CSE的表達(dá)相比，CBS的表達(dá)均顯著低于CSE的表達(dá)。 結(jié)論： 1.成功采用四氯化碳復(fù)合因素法制備大鼠肝硬化模型。 2.肝硬化早、中、晚期大鼠門靜脈血和下腔靜脈血中H2S的含量均顯著低于正常對(duì)照組，且H2S濃度