角蛋白單體誘導(dǎo)Stenotrophomonas maltophilia DHHJ菌株產(chǎn)角蛋白酶解析.pdf

1、禽類羽毛除了少部分用作紡織原料及工藝品應(yīng)用外，絕大多數(shù)被視為廢物丟棄。羽毛的主要成份為角蛋白，適當(dāng)處理后可轉(zhuǎn)化為肽和氨基酸成為農(nóng)業(yè)、日化或醫(yī)藥行業(yè)的產(chǎn)品原料。使用傳統(tǒng)的物理化學(xué)處理方法會對環(huán)境造成很大污染。微生物降解條件溫和，既可避免污染，又可將其轉(zhuǎn)化為可利用的肽氨基酸。人們認(rèn)為酶是大分子物質(zhì)生物降解的關(guān)鍵因素，因此將角蛋白生物降解的研究工作集中在角蛋白酶純化及其理化性質(zhì)、基因工程菌的構(gòu)建等方面。然而角蛋白酶及其工程菌無法很好地降解羽毛

2、角蛋白，說明角蛋白酶是微生物降解羽毛的關(guān)鍵因素，并不是充分因素，羽毛降解過程還需要其他分子的參與。因此研究野生菌降解角蛋白分子的作用機制顯得至關(guān)重要。
　　細(xì)菌降解角蛋白相關(guān)基因的激發(fā)需要將外界信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細(xì)菌細(xì)胞體內(nèi)，而羽毛粉是一種大顆粒不溶性底物，不能直接進入細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號以誘導(dǎo)基因表達(dá)。本實驗室前期研究認(rèn)為不溶性的羽毛粉在細(xì)菌本底表達(dá)的胞外酶作用下，降解為水溶性片段，該片段與細(xì)菌細(xì)胞膜表面受體結(jié)合，受體感應(yīng)后進一步啟動降解系

3、統(tǒng)，將角蛋白徹底分解。本論文就是在該基礎(chǔ)上直接以水溶性角蛋白單體及Stenotrophomonas maltophilia(S.maltophilia) DHHJ為試材，解析角蛋白單體在菌產(chǎn)角蛋白酶中的作用。
　　分別以化學(xué)水解法制備的角蛋白單體（Keratin，分子量約為10 kD）和角蛋白單體酶解后的片段為誘導(dǎo)源，以不添加角蛋白為陰性對照，添加羽毛粉為陽性對照，測定了72 h內(nèi)S.maltophilia DHHJ產(chǎn)生的角蛋白酶

4、的酶活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)無誘導(dǎo)源時，角蛋白酶本底表達(dá)，酶活始終處以一個較低水平（低于0.5 U/mL）；角蛋白單體和羽毛粉均能誘導(dǎo)S.maltophilia DHHJ產(chǎn)生較高酶活，且在誘導(dǎo)48 h后酶活最高，分別可達(dá)20 U/mL和16 U/mL；而以角蛋白單體酶解后的片段為誘導(dǎo)源，測得的酶活低，只有2.3 U/mL。以上結(jié)果表明，羽毛胞外降解的角蛋白單體作為誘導(dǎo)源會啟動角蛋白酶基因表達(dá)。
　　利用熒光標(biāo)記技術(shù)，使用熒光顯微鏡及共聚焦激

5、光掃描顯微鏡（CLSM）進一步明確角蛋白單體與細(xì)菌細(xì)胞的相互作用。S.maltophilia DHHJ分別和異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的角蛋白單體（FITC-Keratin），F(xiàn)ITC-Keratin與牛血清白蛋白（BSA）的混合溶液（FITC-Keratin:BSA），F(xiàn)ITC共培養(yǎng)3 h，檢測其上清與沉淀熒光值的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FITC組的熒光值在上清及沉淀中表現(xiàn)恒定；FITC-Keratin組沉淀的熒光值恒定，上清的熒光值明顯上

6、升；FITC-Keratin:BSA組沉淀及上清的熒光值皆呈現(xiàn)波動式上升，表明BSA與FITC-Keratin對S.maltophilia DHHJ細(xì)胞表面的結(jié)合位點存在競爭性關(guān)系，且S.maltophilia DHHJ會首先選擇結(jié)合BSA。當(dāng)BSA被利用至含量較少時，才會選擇結(jié)合利用FITC-Keratin，此時開啟細(xì)胞內(nèi)的信號通路，激發(fā)了降解角蛋白的相關(guān)基因的表達(dá)并且產(chǎn)生角蛋白酶。本論文結(jié)果為進一步解析角蛋白降解的信號通路奠定了基礎(chǔ)