小麥中隱蔽型脫氧雪腐鐮刀菌烯醇真菌毒素產生規(guī)律及分離純化技術研究.pdf

1、小麥是中國半數以上人口的主要食物來源。小麥及其制品的安全性直接關系到人民的生命安全。小麥、大麥等禾谷類農作物生長及儲存過程中容易受到鐮刀菌屬真菌的侵染，產生有毒的次級代謝產物。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON，嘔吐毒素）是其中最常見的真菌毒素，它是食品中最危險自然發(fā)生而污染的真菌毒素之一。然而，研究的進一步深入發(fā)現被禾谷鐮刀菌侵染后的谷物不僅存在游離態(tài)的DON，還有一些隱蔽型的DON，如乙?；疍ON（3ADON、15ADON）及DON-β-D

2、-葡萄糖苷（D3G）。這些毒素在常規(guī)的提取過程中易被漏檢，當毒素進入人和動物體內后會釋放出DO N毒素，成為潛在的食品安全威脅毒素。但由于現在對隱蔽型DON的產生規(guī)律及毒理性研究還處于初級階段，并且D3G毒素的分離純化方式主要通過化學合成得到的，需要標準品作為合成原料，價格較為昂貴且步驟比較復雜。因此，本研究對DON、D3G、3ADON、15ADON毒素的產生規(guī)律進行探究，并為D3G毒素的分離純化提供一種新的方式，為后續(xù)研究提供充足原料

3、。
　　本研究首先通過將三株不同禾谷鐮刀菌接種不同狀態(tài)的小麥籽粒（高溫高壓滅菌、8kGy輻照、15kGy輻照）進行培養(yǎng)，摸清隱蔽型 DON的產生條件，確定何種狀態(tài)的小麥籽粒能產生隱蔽型DO N；其次通過室內接種實驗及室外大田實驗探究隱蔽型DO N的產生是否與小麥品種、不同禾谷鐮刀菌菌株等因素的關系，探明不同小麥品種，不同菌株與隱蔽型DON的關系；最后通過優(yōu)化禾谷鐮刀菌PH-1的產毒條件，確定何種條件下D3G毒素的累積量最高。并通過

4、優(yōu)化提取條件進行，確定快速、大量提取D3 G毒素的方法。本研究為后續(xù)D3G產生機理研究提供理論依據，為后續(xù)毒理學研究提供簡便低廉快捷制備標準品的方法。本研究主要內容和研究結果如下：
　　1.本研究為了確定麥粒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其隱蔽型的產生與鐮刀菌菌株、小麥籽粒存活狀態(tài)及培養(yǎng)天數的關系，將禾谷鐮刀菌菌株PH-1、F-1和5035分別人工接種至經高溫滅菌、8kGy和15kGy輻照的麥粒中25℃培養(yǎng)7、14、21、28、

5、35d后，通過LC-MS/MS方法測定隱蔽型DON毒素在麥粒中的含量。不同處理的麥粒中DON含量均隨培養(yǎng)時間延長逐漸增加；PH-1接種麥粒培養(yǎng)35d時DON含量最高為624490.25μg/kg。禾谷鐮刀菌接種滅菌麥粒及15kGy輻照麥粒均未檢出D3G毒素；接種8kGy輻照小麥籽粒培養(yǎng)后均可檢出D3G毒素，D3G含量隨著培養(yǎng)天數延長逐漸降低，F-1接種8kGy輻照麥粒的D3G含量顯著（p<0.05）高于PH-1及5035。F-1接種麥粒

6、培養(yǎng)7d時D3G含量最高為15923.43μg/k g。高壓滅菌小麥由于胚芽被破壞不能發(fā)芽，而高劑量15kGy輻照小麥也不能夠發(fā)芽，而8kGy輻照小麥仍保留了75％-80%的發(fā)芽率，卻能夠較好地去除小麥中存在的背景菌。通過本章實驗我們確定只有禾谷鐮刀菌接種能夠發(fā)芽的麥粒才能產生D3G，而乙?；疍ON的產生不受這一因素制約，這一結論為后續(xù)的研究提供依據。
　　2.通過以上研究表明只有8kGy能夠發(fā)芽的小麥才能夠產生 D3G。為了探究

7、不同小麥抗性品種間產生隱蔽型DO N是否存在差異，本部分實驗分為花期前室內胚芽鞘接種與室外大田接種兩部分，探究小麥發(fā)育不同時期毒素累積情況。將三株不同禾谷鐮刀菌接種對鐮刀菌具有不同抗性的揚麥15號、揚麥16號、寧麥13號、蘇麥3號（抗性由低到高排列），研究麥粒中毒素累積情況。實驗結果顯示，室內胚芽鞘實驗表明揚麥15號DON毒素含量顯著性（p<0.05）高于蘇麥3號，而揚麥15號D3G毒素含量顯著性（p<0.05）低于蘇麥3號；大田接種實

8、驗中，揚麥15號的病小穗率最高；D3G/總DON與病小穗率具有相關性，PH-1接種小麥相關性最高 R2=0.91；通過本章的實驗推測感染禾谷鐮刀菌的小麥 D3 G的累積情況與小麥的抗性有一定關系。
　　3. D3G是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的一種結合態(tài)衍生物，可以逃脫常規(guī)的檢測。然而，少量毒理學研究表明D3G經過哺乳動物的胃腸消化道后會釋放出其有毒前體物質。為了食品安全檢測及毒理學實驗提供純化后的D3G，我們嘗試了一種經濟和能夠重復的純

9、化方法。首先，通過將禾谷鐮刀菌菌株PH-1接種后，在不同溫度和水分活度下培養(yǎng)，確定溫度為25℃、Aw=0.99時，D3 G毒素累積量最高。其次，將接種后小麥粉碎后加入乙腈/水/乙酸提?。?9/20/1，v/v/v）經旋轉蒸發(fā)蒸干。剩余的液體用乙酸乙酯提取，將水層收集后，真空冷凍干燥，經后續(xù)純化過程得到 D3 G毒素。通過比較幾種不同提取溶劑，乙腈/水/乙酸提取效果最好，得到最終產品的相對回收率為85%。本實驗利用接種輻照小麥提取 D3G