脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抗原設(shè)計(jì)及直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）半抗原的分子設(shè)計(jì)是建立其免疫分析方法的關(guān)鍵步驟，目前，DON 半抗原設(shè)計(jì)仍采用經(jīng)驗(yàn)法，造成時(shí)間和資金的浪費(fèi)。本文從半抗原設(shè)計(jì)的最大原則（不改變待分析物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)）出發(fā)，明確DON 最佳半抗原的設(shè)計(jì)思想：最大化抗原表位相似度。利用分子模擬技術(shù)，通過(guò)分析分子的空間構(gòu)型、電子特性、疏水性質(zhì)這幾個(gè)影響抗原-抗體間作用力的因素在DON 修飾前后的變化，研究半抗原結(jié)構(gòu)與免疫識(shí)別之間的關(guān)系，建立DON 半抗原設(shè)計(jì)的理論模擬

2、方法，為小分子半抗原設(shè)計(jì)提供新的思路，并在此基礎(chǔ)上建立了DON的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法。
　　 根據(jù)DON 抗原設(shè)計(jì)流程：選擇結(jié)合位點(diǎn)→引入連接臂→偶聯(lián)載體蛋白，首先研究結(jié)合位點(diǎn)對(duì)DON 免疫識(shí)別的影響，在DON分子中的4個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)（3,7，15位羥基以及 8位酮基）引入相同碳鏈長(zhǎng)度的的連接臂，借助分子模擬軟件Hyperchem7.5 對(duì)DON及半抗原的表位決定參數(shù)（空間結(jié)構(gòu)、原子點(diǎn)電荷、疏水常數(shù)）進(jìn)行計(jì)算分析,3位半抗原

3、具有與DON最相似的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，表明3位是DON 引入連接臂的最佳位點(diǎn)，這與Casale和Ramesh的免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。其次，在3位羥基上設(shè)計(jì)不同的連接臂結(jié)構(gòu)，通過(guò)抗原表位相似度模擬篩選得到最佳連接臂結(jié)構(gòu)：丁二酸酐臂。同時(shí)合成不同連接臂的DON 完全抗原，并將之進(jìn)行免疫抗體實(shí)驗(yàn)，測(cè)定抗體的效價(jià)以及抑制率，驗(yàn)證分子模擬結(jié)果，研究半抗原結(jié)構(gòu)對(duì)抗體免疫活性的關(guān)系。結(jié)果表明B組（順丁烯二酸酐臂）抗體平均效價(jià)：256000，A組（丁二酸酐臂）、C

4、組（鄰苯二甲酸酐臂）平均效價(jià)：64000；DON 濃度為500 ng/ml時(shí)對(duì)抗體的抑制率分別：A組（66.4 ％）＞B組（21.1 ％）＞C組（10.8 ％）。抑制率的大小與抗體對(duì)DON的特異性相關(guān)，A組與DON具有最高的抗原表位相似度，抗體對(duì)DON的特異性強(qiáng)，抑制率高；抗體的效價(jià)可以反映半抗原分子的抗原性，苯環(huán)結(jié)構(gòu)、不飽和鍵可以增強(qiáng)抗原性，B組連接臂中含有不飽和鍵，增強(qiáng)了半抗原的抗原性，產(chǎn)生的抗體效價(jià)高；C組雖含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，確未能產(chǎn)

5、生高效價(jià)的抗體，結(jié)合其空間結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)C組半抗原中羧基端與半抗原主體結(jié)構(gòu)非?？拷?，半抗原結(jié)構(gòu)可能被載體蛋白屏蔽而影響免疫識(shí)別；綜合考慮，丁二酸酐臂是DON的最佳連接臂，免疫試驗(yàn)結(jié)果與分子模擬具有很好的相關(guān)性。
　　 在最佳半抗原基礎(chǔ)上，比較BSA和KLH兩種載體蛋白的DON 完全抗原的免疫原性。通過(guò)丁二酸酐衍生法和碳二亞胺法（EDC法）制備不同載體蛋白的DON 完全抗原，免疫新西蘭長(zhǎng)耳兔獲得DON 抗體，并運(yùn)用酶聯(lián)免疫方法（ELIS

6、A）對(duì)制備的抗體進(jìn)行研究。
　　 在上述研究結(jié)果基礎(chǔ)上合成DON-KLH 完全抗原，建立DON的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法，通過(guò)一步抗原抗體反應(yīng)，快速檢測(cè)食品中DON。檢測(cè)范圍為1-100 ng/mL。半數(shù)抑制率IC50為10 ng/mL，最低檢出限為0.56 ng/mL，與T-2 毒素等真菌毒素的交叉反應(yīng)率小于12 ％；平均批內(nèi)變異系數(shù)為2.82 ％，平均批間變異系數(shù)為14.54 ％；對(duì)玉米粉的加標(biāo)回收率在80.2-91.1 ％