脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）檢測(cè)方法的研究.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)是鐮刀菌產(chǎn)生的一種真菌毒素，主要污染谷物及其制品。食用污染毒素的谷物，如病麥及其制成品后會(huì)引起人畜中毒，還有致癌、致畸和誘變的作用。谷物往往是通過(guò)產(chǎn)毒真菌的感染而污染毒素的，如小麥赤霉病，是影響我國(guó)南方麥區(qū)、東北春麥區(qū)以及黃淮流域麥區(qū)的重要病害，可由多種鐮刀菌引起，但主要致病種是禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)。鐮刀菌引起小麥的穗腐，不僅使小麥籽粒產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣，而且病麥粒中存留有病

2、菌產(chǎn)生的真菌毒素，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)，但是我國(guó)相關(guān)的研究比較少，特別是檢測(cè)水平偏低。因此，對(duì)我國(guó)禾谷鐮刀茵產(chǎn)毒特點(diǎn)進(jìn)行分析，并改進(jìn)毒素檢測(cè)方法，對(duì)我國(guó)麥制品中真菌毒素含量進(jìn)行日?；暮蜆?biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)，并發(fā)布相關(guān)毒素污染情況是非常必要的。 本論文對(duì)DON的快速檢測(cè)進(jìn)行了研究，建立并比較了理化檢測(cè)方法和免疫學(xué)檢測(cè)方法，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： @ @ 1、為了獲得大量DON，將禾谷鐮刀菌菌株

3、進(jìn)行了產(chǎn)毒培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌在約含25％水的小麥培養(yǎng)基中，25℃，振蕩培養(yǎng)30天，產(chǎn)毒量最高； 2、DON的提取試驗(yàn)結(jié)果表明，小麥樣品宜用乙腈-水(84:16，V／V)提取，硅鎂型吸附劑柱凈化； 3、建立了薄層層析(TLC)檢測(cè)DON的方法：以展開(kāi)劑氯仿：甲醇(90:10)展開(kāi)DON毒素的Rf值約為0.45，DON在365nm紫外光下顯藍(lán)色熒光，經(jīng)20％硫酸噴霧并加熱后，DON樣點(diǎn)呈玫瑰紅或玫瑰紫色； 4

4、、建立了高效液相色譜紫外分析(HPLC-UV)檢測(cè)DON的方法：以kromasil C-18分析柱(4.6×250mm)為固定相，乙腈-水(84:16)為流動(dòng)相，流速為0.8mμL／min，進(jìn)樣量為20gL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為218nm，毒素DON的檢測(cè)譜峰峰形清晰明顯，無(wú)干擾，保留時(shí)間為8分鐘左右。該法最低檢出限為0.1 ng／μL，線性范圍為0.1-10ng／μL； 5、建立了氣相色譜．質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)檢測(cè)DON的方法：毒

5、素經(jīng)C<,18>／Al<,2>O<,3>柱(1／3)濾去色素，用三甲基硅烷基衍生劑YMS衍生化，然后以DB-5MS石英交聯(lián)毛細(xì)管柱(30 em×0.25 mm×0.25 μm)為固相，純氦氣為載氣，流速為1 mL／min進(jìn)行氣相色譜；以EI為離子源，掃描間歇1.0 s進(jìn)行質(zhì)譜分析，特異性好，結(jié)果穩(wěn)定，而且用GC-MS與HPLC檢測(cè)DON濃度誤差不顯著； 6、建立了薄層層析(TLC)的定性檢測(cè)及高效液相色譜(HPLC)的定量檢測(cè)相

6、結(jié) 合的方法：即將含有DON的混合物先用TLC分析，然后將顯現(xiàn)熒光區(qū)分段回收進(jìn)行HPLC檢測(cè)，確定DON組分在TLC的分布及其含量；該研究方法可為其他毒素的檢測(cè)提供參考；7、合成DON完全抗原：先使DON衍生后獲得一個(gè)羧基，再通過(guò)碳化二亞胺法合成DON的蛋白偶聯(lián)物(3-HS-DON-BSA或3-HS-DON-OVA)，即DON的完全抗原。 8、建立檢測(cè)DON的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法：完全抗原的最適包被工作濃度為1∶400，B