脫氧雪腐鐮刀菌烯醇噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建及原核表達(dá).pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是由多種鐮刀屬真菌代謝產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物。隨著小麥赤霉病的發(fā)生，DON的污染廣泛分布于世界各地，是食品和飼糧中污染率最高的霉菌毒素之一。蓄積在糧食中的DON被人畜攝食后，多表現(xiàn)出急性的嘔吐和拒食反應(yīng)，并且對(duì)機(jī)體產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制、免疫抑制、胚胎和細(xì)胞毒性，對(duì)畜禽和人的健康危害極大。
　　因此，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品和食品中DON的檢測(cè)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選到抗DON

2、的單鏈抗體，并進(jìn)行初步的原核表達(dá)，為噬菌體單鏈抗體在DON檢測(cè)中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)Ⅰ脫氧雪腐鐮刀菌烯醇人工抗原的合成通過(guò)琥珀酸酐在DON的3位羥基上引入琥珀酸連接臂，采用活潑酯法在連接臂上偶聯(lián)牛血清蛋白BSA制備免疫抗原DON-HS-BSA。采用CDI法直接偶聯(lián)DON和卵清白蛋白OVA制備檢測(cè)抗原DON-OVA。通過(guò)紫外吸收光譜法和DON的ELISA檢測(cè)試劑盒鑒定偶聯(lián)成功。
　　試驗(yàn)ⅡDON雜交瘤細(xì)胞的制備與

3、鑒定以DON-HS-BSA為抗原免疫BALB/c，取免疫后小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0進(jìn)行融合，制備雜交瘤細(xì)胞，以O(shè)VA-DON為檢測(cè)抗原，采用間接ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，使用有限稀釋法進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞亞克隆。結(jié)果表明，免疫小鼠血清效價(jià)最高為1∶2000;篩選出1株穩(wěn)定分泌IgG2a，輕鏈為九鏈的DON雜交瘤細(xì)胞株。
　　試驗(yàn)ⅢDON噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建、篩選和原核表達(dá)以DON雜交瘤細(xì)胞為基因來(lái)源，利用設(shè)計(jì)引物，經(jīng)RT

4、-PCR擴(kuò)增小鼠IgG的重鏈、輕鏈可變區(qū)基因，并通過(guò)(Gly4Ser)3多肽Linker拼接VL-Linker-VH，并擴(kuò)增得到單鏈抗體ScFv基因片段。利用SfiⅠ和NotⅠ雙酶切后連接ScFv基因和噬菌粒載體pCANTAB5E，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliTG1，經(jīng)輔助噬菌體M13K07進(jìn)行噬菌體拯救構(gòu)建DON噬菌體單鏈抗體庫(kù)。用DON檢測(cè)抗原進(jìn)行phage-ELISA，對(duì)噬菌體重組抗體進(jìn)行免疫親和、富集和篩選。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)三輪富集后