牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成脂誘導(dǎo)中Wnt-β--catenin信號(hào)通路相關(guān)miRNA的鑒定及分析.pdf

1、分化的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是一類(lèi)多能干細(xì)胞，它不僅存在于幼年動(dòng)物，而且存在于成年哺乳動(dòng)物。之前的研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)控多能細(xì)胞分化，并且對(duì)于多能細(xì)胞的成脂分化至關(guān)重要。MicroRNA是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種內(nèi)源性非編碼RNA，并且在動(dòng)物脂肪形成過(guò)程中起著非常重要的作用，然而miRNA在Wnt信號(hào)介導(dǎo)下牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成脂誘導(dǎo)中的作用卻很少受到關(guān)注。
　　1、牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞原代培養(yǎng)以及鑒定
　　本試驗(yàn)采

2、取肉牛后腿骨骼肌組織，通過(guò)機(jī)械分離將細(xì)胞剪碎后用膠原酶和胰蛋白酶雙酶法消化為單個(gè)細(xì)胞后，采用差速貼壁法純化貼壁細(xì)胞，從而獲得骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞;通過(guò)對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化顯示，細(xì)胞在第二天開(kāi)始有部分肌纖維出現(xiàn)，在第四天時(shí)，已有大量肌纖維出現(xiàn)，并且開(kāi)始融合為粗大的肌管;通過(guò)成脂誘導(dǎo)分化顯示在誘導(dǎo)分化12天后，用油紅O染色，可以看到有脂滴形成并被染色，說(shuō)明其分化性良好;通過(guò)免疫熒光技術(shù)對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞特異性基因Pax7進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示95％

3、以上細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。
　　2、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成脂誘導(dǎo)中Wnt/β-catenin信號(hào)相關(guān)miRNA表達(dá)譜研究
　　LiCl激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，通過(guò)成脂誘導(dǎo)分化，基因芯片技術(shù)篩選了成脂分化過(guò)程中不同組差異表達(dá)的miRNA，并且通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)這些差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行分析，結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，在783個(gè)已知的牛miRNA中有29個(gè)差異表達(dá)(foldchang

4、e＞2)，其中有12個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，17個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào);生物信息結(jié)果顯示，有24個(gè)miRNA與脂肪代謝、細(xì)胞分化，以及免疫系統(tǒng)有關(guān);在315個(gè)靶基因中有39個(gè)靶基因不同程度的參與了脂肪細(xì)胞的形成、代謝以及干細(xì)胞的分化和免疫反應(yīng)。GO分析以及KEGG通路表明，這些差異表達(dá)的miRNA通過(guò)不同通路和靶基因參與了骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)。綜上所述，我們研究首次在Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控下牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成脂誘導(dǎo)中對(duì)m