miR-206對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的影響研究.pdf

1、microRNA(miRNA)是真核生物中一類約22bp大小的的非編碼RNA小分子，通過與靶基因mRNA3'端非翻譯區(qū)特異性的結(jié)合而導(dǎo)致靶mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而對基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，是一類重要的調(diào)節(jié)因子。microRNA(miRNA)參與的生命過程包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分化等。隨著越來越多microRNA的發(fā)現(xiàn)以及功能與調(diào)節(jié)通路的闡明，microRNA已經(jīng)成為當(dāng)前生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究表明，micro

2、RNA在肌肉發(fā)育過程中也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。在生物體內(nèi)microRNA的表達(dá)具有組織特異性，一些學(xué)者把在肌肉中特異表達(dá)的microRNA命名為MyomiRs家族，包括miR-1、miR-133a、miR-206等等。MyomiRs的大部分成員在心肌和骨骼肌中都有表達(dá)，但是只有miR-206為骨骼肌特異性表達(dá)，所以本實(shí)驗(yàn)選擇骨骼肌特異性的miR-206為研究對象。
　　 本文以原代培養(yǎng)的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，通過Real

3、Time PCR檢測正常培養(yǎng)的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在分化不同時期miR-206的表達(dá)量。同時通過轉(zhuǎn)染miR-206的真核表達(dá)載體研究miR-206對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的影響，結(jié)果表明:
　　 使用膠原酶XI與胰蛋白酶相結(jié)合的方法，經(jīng)過差速貼壁成功分離了原代牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。細(xì)胞生長狀態(tài)良好，在含有2％馬血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，細(xì)胞能夠分化并融合形成多核的肌管;分化效率較高，免疫熒光染色顯示細(xì)胞內(nèi)骨骼肌標(biāo)志性分子呈陽性表達(dá)。
　　

4、 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證miR-206在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化不同時期呈現(xiàn)出差異表達(dá)的情況，在未分化細(xì)胞中表達(dá)量最低，隨著分化時間的延長其表達(dá)量逐漸上調(diào)，在第五天表達(dá)量為最高。通過轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-miR-206與對照組相比，過表達(dá)miR-206對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞有促進(jìn)分化的作用。C2C12細(xì)胞是體外分化的理想模型，同樣我們檢測其分化不同天數(shù)miR-206的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-206的表達(dá)水平也是在第