Wnt-β-catenin信號(hào)通路在腹膜透析腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是治療終末期腎臟疾病(endstage renal disease，ESRD)的重要替代治療方法之一。但是，長期暴露于高糖腹膜透析液最終可導(dǎo)致腹膜組織纖維化(peritonealfibrosis，PF)，透析效能降低，最終導(dǎo)致超濾衰竭(ultrafiltration faifure，UFF)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和長期存活率。近期研究發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞一間充質(zhì)細(xì)

2、胞轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是腹膜纖維化過程中的觸發(fā)和始動(dòng)因素，它可導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞失去間皮細(xì)胞的特點(diǎn)，向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，是腹膜功能退化的關(guān)鍵過程。目前認(rèn)為，在眾多調(diào)節(jié)間皮細(xì)胞EMT的細(xì)胞因子和介質(zhì)中，轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factorβ，TGF-β)是最關(guān)鍵的因素。但是，目前

3、腹膜纖維化的機(jī)制仍未完全闡明，且尚無有效的治療方式。
　　Wnt蛋白是一類富含半胱氨酸的分泌型脂化糖蛋白，參與調(diào)控了器官發(fā)育，細(xì)胞分化增殖，細(xì)胞極性以及細(xì)胞遷移。Wnt蛋白通過三條信號(hào)通路發(fā)揮作用，最經(jīng)典的為β-catenin介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路。近年來的研究顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常活化與許多疾病，如腫瘤、遺傳性疾病和器官纖維化等相關(guān)，并已證明其參與EMT的發(fā)生。此外，研究證實(shí)Wnt/β-

4、catenin與TGF-β信號(hào)交互作用，參與介導(dǎo)了TGF-β誘導(dǎo)多種細(xì)胞EMT及纖維性疾病的發(fā)生過程?；谝陨戏治?，我們認(rèn)為，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)控腹膜透析腹膜間皮細(xì)胞EMT及腹膜纖維化的過程。為此，本研究開展如下。
　　第一章腹透流出液間皮細(xì)胞Wnt/β-catenin通路活性與EMT的關(guān)系研究。
　　目的：
　　檢測腹膜透析患者腹膜透析流出液細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)及EMT

5、發(fā)生情況，初步探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腹膜間皮細(xì)胞EMT及腹膜纖維化的關(guān)系
　　方法：
　　隨機(jī)選取新開管持續(xù)不臥床腹膜透析患者12人，腹透一年以上者12人，分離培養(yǎng)并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定透析流出液細(xì)胞。通過Realtime-PCR檢測流出液細(xì)胞Wnt(1，2，3，3a，4，5a，7b，8a，10a)，β-catenin，DKK1(Dickkopf1)，淋巴樣增強(qiáng)結(jié)合因子1(Lymphoidenhancer-bi

6、ndingfactor1， LEF1)，α-肌動(dòng)蛋白(smooth muscleactin-alpha，α-SMA)，E-鈣粘蛋白(E-Cadherin)，膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ，ColⅠ)，纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)，基質(zhì)金屬蛋白酶-7(Matrix Metallo proteinases-7，MMP-7)的表達(dá)，Western Blot檢測流出液細(xì)胞β-catenin，E-Cadherin，α-SMA，CO

7、L-Ⅰ的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　(1)腹透流出液細(xì)胞經(jīng)鑒定為腹膜間皮細(xì)胞，且細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)纖維樣改變。(2)透析一年以上組α-SMA，ColⅠ，F(xiàn)N表達(dá)明顯高于新開管組，E-Cadherin表達(dá)明顯低于新開管組(3)透析一年以上組Wnt1，Wnt5a，Wnt7b，Wnt8a mRNA表達(dá)明顯高于新開管組，且β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于新開管組(4)透析一年以上組DKK1，LEF1及MMP-7 mRNA表達(dá)高于

8、新開管組。
　　結(jié)論：
　　隨腹膜透析時(shí)間延長，Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性顯著升高，腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT改變，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路可能與腹膜透析腹膜間皮細(xì)胞EMT及腹膜纖維化相關(guān)。
　　第二章 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞EMT中的作用。
　　目的：
　　探討Wnt/β-catenin在高糖誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞EMT中的作用。
　　方法：

9、r>　　用不同濃度（30，60，90mM）高葡萄糖刺激人腹膜間皮細(xì)胞株（HMrSV5）細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(0，12，24，48h)，通過免疫熒光、realtimePCR及western blot檢測細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA、ColⅠ、FN及β-catenin、Wnt1，5a、LEF1的表達(dá);轉(zhuǎn)染DKK1質(zhì)粒，再予60mM高糖刺激，通過細(xì)胞免疫熒光、realtime PCR及western blot檢測HMrSV5細(xì)胞E-cad

10、herin、αt-SMA、ColⅠ、FN及β-catenin、LEF1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　高糖刺激后，人腹膜間皮細(xì)胞E-cadhefin mRNA及蛋白表達(dá)降低，α-SMA及ColⅠ、FN mRNA及蛋白表達(dá)水平升高;β-catenin、Wnt1，5a、LEF1表達(dá)呈時(shí)間及濃度依賴性降低。與高糖刺激組相比較，過表達(dá)DKK1使β-catenin、LEF1表達(dá)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，α-SMA及ColⅠ表達(dá)

11、下調(diào);但轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞β-catenin、LEF1、E-cadherin、α-SMA及ColⅠ的表達(dá)變化無明顯影響。
　　結(jié)論：
　　高糖誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞Wnt/β-catenin異常活化;過表達(dá)DKK1拮抗Wnt/β-catenin信號(hào)抑制高糖誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞EMT。
　　第三章 Wnt/β-catenin信號(hào)在TGFβ1誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞EMT中的作用。
　　目的：
　　探討W

12、nt/β-catenin在TGFβ1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞EMT中的作用。
　　方法：
　　用不同濃度TGFβ1(2.5，5，10ng/ml)刺激HMrSV5細(xì)胞，通過免疫熒光、realtime PCR及western blot檢測細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA、ColⅠ及β-catenin、Wnt1，5a、LEF1的表達(dá);轉(zhuǎn)染DKK1質(zhì)粒及陰性對(duì)照空質(zhì)粒，再予TGFβ1刺激，通過細(xì)胞免疫熒光、realtime PCR

13、及western blot檢測HMrSV5細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、ColⅠ及β-catenin、LEF1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　TGFβ1刺激后，人腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，α-SMA及ColⅠmRNA及蛋白表達(dá)水平升高;β-catenin、Wnt1，5a、LEF1 mRNA表達(dá)呈濃度依賴性升高。與TGFβ1刺激組相比較，過表達(dá)DKK1使β-catenin、LEF1表達(dá)