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文檔簡介
1、為了分離純化禽源致病性大腸埃希菌的噬菌體并測定其性質(zhì),將近4000份鴨糞樣品來源于安徽和縣某兩個規(guī)?;唸黾澳暇┠呈袌瞿厨唸龅镍喖S樣品離心、過濾后提取上清液,采用點(diǎn)滴法和雙層瓊脂法對致病性大腸桿菌噬菌體進(jìn)行鑒定、純化并保存,結(jié)果共分離鑒定了136株大腸埃希菌烈性噬菌體,并對其中的四十余株進(jìn)行了生物特性學(xué)分析,包括透射電鏡觀察,宿主譜測定等,對其中的HX01,NJ01進(jìn)行了基因組提取并全基因組測序。以噬菌體NJ01為例,透射電鏡下結(jié)構(gòu)判定
2、為短尾噬菌體科(Podoviridae)。宿主范圍較窄,僅能裂解被測大腸桿菌中的三株:DE172、NJ01和MC1061。效價為1.33×1013pfu/ml,將純培養(yǎng)物稀釋至108PFU/mL,每隔15min(至4h)測其一步生長曲線,表明潛伏期為30min,平均裂解量為157PFU/cell,最佳感染復(fù)數(shù)為100。
采用自己優(yōu)化改進(jìn)過噬菌體基因組提取和純化方法,制備了高質(zhì)量的烈性噬菌體HX01和NJ01的基因組,并通過第二
3、代高通量測序技術(shù)進(jìn)行了全基因組測序,以NJ01為例,測序結(jié)果顯示:NJ01全基因組大小為77,448bp,G+C含量為42.05%,共包括個136ORF以及1tRNA,并進(jìn)行了詳細(xì)注釋。NJ01屬于典型的C3分型,對NJ01根據(jù)“DNA包裝整合—頭部—尾部—尾絲蛋白—裂解相關(guān)模塊—DNA復(fù)制—轉(zhuǎn)錄”的分子模塊展開分析。對NJ01、phiEco32和KBNK135進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)了一些特殊的功能基因:如只存在于NJ01的ORF
4、52,ORF45、ORF89等均存在于三者中,但是組成、長度卻完全不同等。在對與吸附特異性密切相關(guān)的尾絲蛋白研究時發(fā)現(xiàn):一個由320個氨基酸組成的保守區(qū)域的存在,此結(jié)果極有可能成為未來研究的熱點(diǎn)。比較基因組學(xué)分析顯示了NJ01與phiEco32的親緣和進(jìn)化關(guān)系非常接近,但也由于這種接近,而在宿主范圍和分離地上的巨大差別,這更能提示利用比較基因組學(xué)分析對于噬菌體功能基因的構(gòu)成研究和通過改造基因組組成來擴(kuò)大宿主譜研究的必要性。
為
5、了進(jìn)一步確實NJ01的結(jié)構(gòu)蛋白蛋白,對全噬菌體的制備和純化方法進(jìn)行了摸索并成功制備得到NJ01全噬菌體樣品,并將它經(jīng)二維電泳展示于二維凝膠進(jìn)行蛋白組學(xué)分析,并進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測,共篩選出13個點(diǎn)(包括8種重要結(jié)構(gòu)蛋白),包括尾蛋白、棘絲蛋白,主要頭部蛋白以及DNA注射蛋白等。讓我們對于噬菌體的結(jié)構(gòu)組成和以后的比較基因組學(xué)分析有了更直觀和立體的認(rèn)識,同時豐富了基因組的注釋和解讀。
噬菌體用于抗菌治療和預(yù)防細(xì)菌感染已
6、有很長的歷史,禽源大腸桿菌病可引起禽類的敗血癥、心包炎、腹膜炎等。為了探索已分離到的烈性噬菌體對于禽源大腸桿菌感染的療效,將南京某市場鴨糞樣品中分離到的烈性噬菌體,以宿主菌為DE172的烈性噬菌體NJ01為例。首先利用成熟的小鼠身上APEC感染模型,計算DE172的半數(shù)致死量。之后以2倍的半數(shù)致死量感染小鼠,實驗組包括:感染細(xì)菌后不同時間注射等量、同濃度噬菌體,對照組設(shè)立正常小鼠腹腔中注射噬菌體的空白對照組和感染對照組,以達(dá)到綜合分析的
7、目的。測得:DE172的半數(shù)致死量為LD50=1×107CFU/mL,利用分離并純化至濃度為1×1011PFU/ml的噬菌體NJ01在感染后0、3.5、4.5、5.5、6.5和7.5h取0.2ml分別進(jìn)行腹腔注射治療,治療當(dāng)天,治療組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;三天后除E、F、H組外,其余小鼠均死亡,治療組與對照組有所差異,三天后治療組與對照組之間差異數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。短期內(nèi)噬菌體在小鼠體內(nèi)會作為異物代謝掉,而在殘存小
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