大腸桿菌基因組水平蛋白質(zhì)-RNA相互作用初步研究.pdf

1、隨著人類全基因組計(jì)劃的完成，發(fā)現(xiàn)近95％的基因組序列將產(chǎn)生成千上萬的非編碼RNAs(noncoding RNA, ncRNA)，一類能被轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白質(zhì)且具有特定功能的RNAs。現(xiàn)在研究較多的是各種具有調(diào)控功能的非編碼RNAs，涉及微小RNA(microRNAs，miRNA)，小于擾RNA(small interfering RNAs，siRNA)，與PIWI蛋白相互作用的RNA(Piwi-interacting RNAs，piRNA

2、)以及一類長(zhǎng)度超過200bp的也具有調(diào)控功能的大分子非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNA)。這些具有調(diào)控功能的ncRNA通常都是和蛋白質(zhì)相互作用而發(fā)揮其功能，例如miRNA需要通過與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合從而抑制靶標(biāo)mRNA表達(dá)。在研究miRNA的過程中，人們發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象，是siRNA沉默靶基因表達(dá)的過程。 siRNA通常是由

3、Dicer酶切割外源雙鏈RNA產(chǎn)生，在細(xì)胞內(nèi)通過與AGO蛋白相互作用進(jìn)而降解靶標(biāo)mRNA，除此以外，還有報(bào)道siRNA能夠引導(dǎo)DNA修飾酶影響染色體結(jié)構(gòu)。從哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞中分離得到的一類長(zhǎng)度約為30 nt的piRNA，也需要與PIWI蛋白家族成員相結(jié)合才能發(fā)揮它的調(diào)控作用。目前報(bào)道表明，lncRNA能通過結(jié)合到特定蛋白質(zhì)，可在染色體修飾、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)節(jié)功能。原核生物中有一類小調(diào)控RNA(small regulato

4、ry RNAs，sRNA)，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中也有重要作用，包括調(diào)控碳的攝入、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、生物膜形成、群落感應(yīng)與細(xì)菌致病性等生理過程。在一些簡(jiǎn)單的生命體中蛋白質(zhì)-RNA相互作用也有重要作用，如RNA病毒可直接由蛋白質(zhì)與RNA組裝成病毒顆粒，整個(gè)復(fù)制過程都不需要DNA的幫助。
　　由此可見，蛋白質(zhì)-RNA相互作用在生物中廣泛存在并具有重要作用。然而由于生物技術(shù)或者實(shí)驗(yàn)方法的滯后，在十年前開展基因組水平蛋白質(zhì)-RNA相互作用研究非常

5、困難。現(xiàn)在隨著生物技術(shù)如基因芯片和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，才使得人們?cè)诨蚪M水平上研究蛋白質(zhì)-RNA相互作用成為可能。目前研究蛋白質(zhì)-RNA相互作用的方法可以按照目標(biāo)分為兩類，一類是以RNA為中心，通過RNApull-down技術(shù)得到與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，一類是以蛋白質(zhì)為中心，通過免疫共沉淀得到與蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA。為了知道蛋白質(zhì)結(jié)合RNA的確切位置，人們發(fā)展了紫外交聯(lián)免疫共沉淀技術(shù)(ultraviolet cross-linking a

6、nd immunoprecipitation，CLIP)，該方法主要步驟為，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行254nm紫外交聯(lián)，用RNA酶處理裂解液，部分消化RNA，免疫共沉淀得到蛋白-RNA復(fù)合體，最后用蛋白酶消化蛋白即可得到與蛋白結(jié)合的RNA片段。起初通過CLIP得到的RNA只能利用第一代測(cè)序分析，不適用于大規(guī)模樣本以及轉(zhuǎn)錄組水平的研究。于是有研究將CLIP與高通量測(cè)序結(jié)合（High-throughput sequencing clip，HITS-CLI

7、P），對(duì)CLIP得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行高通量測(cè)序分析，從而實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄組水平蛋白質(zhì)-RNA相互作用研究。在CLIP過程中，由于紫外交聯(lián)不可逆，蛋白酶消化蛋白-RNA復(fù)合體的蛋白后得到的RNA片段可能會(huì)有與之交聯(lián)的氨基酸殘留，在逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA時(shí)，交聯(lián)位點(diǎn)可能產(chǎn)生突變，甚至導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶不能讀通RNA，產(chǎn)生截短體eDNA，因此而丟失部分信息。為了避免截短體丟失對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)的影響，衍生出單個(gè)核苷酸分辨率的CLIP(individual-nucleot

8、ide resolution CLIP, iCLIP)，以及為了提高交聯(lián)效率的光活性增強(qiáng)的核糖核苷CLIP(Photoactivatable ribonucleoside-enhanced CLIP, PAR-CLIP)。
　　然而已有的方法都是基于單個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行CLIP，從而得到與感興趣蛋白結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本信息。在細(xì)菌中有4000多個(gè)蛋白質(zhì)，如果仍然采用這種研究方法，則需要耗費(fèi)大量人力和經(jīng)費(fèi)。為此本研究以模式生物大腸桿菌為例，結(jié)合高

9、通量測(cè)序技術(shù)，探討了基因組水平的蛋白質(zhì)-RNA相互作用研究策略。首先，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行紫外交聯(lián)，將體內(nèi)蛋白質(zhì)與RNA形成的復(fù)合體固定，另設(shè)置一組不經(jīng)紫外交聯(lián)作為對(duì)照組，除了紫外交聯(lián)，其余步驟完全一致。接著利用高濃度的RNA酶消化細(xì)菌裂解液，以去除細(xì)胞中沒有和蛋白質(zhì)相互作用的RNA，滅活RNA酶后用蛋白酶消化蛋白，酸性水飽和酚提取被蛋白質(zhì)保護(hù)的RNA片段，用變性聚丙烯酰胺凝膠選擇合適大小的RNA片段構(gòu)建cDNA文庫(kù)，經(jīng)PCR富集后進(jìn)行高通量測(cè)序

10、，通過綜合已有的方法和自行開發(fā)的生物信息學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，初步獲得了大腸桿菌中基因組水平的PRI信息。
　　文庫(kù)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)，通過去接頭和質(zhì)量控制等預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別獲得了12，028，608條和11，106，770條讀段。運(yùn)用Bowtie軟件將干凈讀段定位于參考基因組上，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別有11，896，126條讀段和10，962，375條可以比對(duì)到大腸桿菌基因組。唯一定位的實(shí)驗(yàn)組有799，229條讀段和來自對(duì)

11、照組的862，516條讀段。
　　基于MCA分析得到與蛋白質(zhì)結(jié)合的2421條轉(zhuǎn)錄本，其中有1787個(gè)mRNA、29個(gè)sRNA、33個(gè)tRNA、11個(gè)rRNA以及561個(gè)IGR。運(yùn)用dCLIP最終得到2455條轉(zhuǎn)錄本，含有1763個(gè)mRNA、43個(gè)sRNA、10個(gè)rRNA、35個(gè)tRNA以及604個(gè)IGR。運(yùn)用Piranha分析得到244個(gè)轉(zhuǎn)錄本，涉及149個(gè)mRNA，16個(gè)sRNA，9個(gè)rRNA，24個(gè)tRNA以及46個(gè)IGR。經(jīng)

12、過仔細(xì)分析，我們選擇MCA和dCLIP兩種方法結(jié)果的并集作為最終的與蛋白結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本，總共得到3193條轉(zhuǎn)錄本，包含2234個(gè)mRNA、47個(gè)sRNA、11個(gè)rRNA、39個(gè)tRNA以及862個(gè)IGR。我們考察了結(jié)果中的47個(gè)sRNA，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)sRNA沒有被報(bào)道與蛋白質(zhì)結(jié)合，并且其中有3個(gè)sRNA(RyfD，RyjB，SymR)在MCA和dCLIP以及Piranha3種分析方法中重疊。另外我們通過與大腸桿菌sRNA預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)比較發(fā)現(xiàn)，

13、有178條轉(zhuǎn)錄本可能是與蛋白質(zhì)結(jié)合的新sRNA。
　　總之，本研究首次在原核系統(tǒng)中開展了基因組水平的蛋白質(zhì)-RNA相互作用研究，構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)流程可以為在其他物種中研究蛋白質(zhì)-RNA相互作用提供借鑒。通過高通量測(cè)序初步獲得大腸桿菌基因組水平蛋白質(zhì)-RNA相互作用信息，綜合運(yùn)用已發(fā)表的兩種生物信息分析方法以及本研究新提出的MCA分析方法得到大量轉(zhuǎn)錄本信息。通過與已知的蛋白質(zhì)-RNA相互作用數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)其中一部分sRNA沒有被報(bào)道與蛋白