禽致病性大腸桿菌O2-K1菌株IMT5155基因組特征及DE205B株黏附素和轉錄因子的功能研究.pdf

1、禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC)是一類典型的腸道外致病性大腸桿菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli，ExPEC)，APEC通過呼吸道感染禽類，在呼吸道和肺組織定殖，強毒株能引起肺組織的嚴重病變和炎癥反應，包括氣囊炎和肺炎，強毒株可以突破肺臟的免疫防御進入血液，進而引起敗血癥和多系統(tǒng)混合感染。禽大腸桿菌病(Avian Colibacillos

2、is)是危害養(yǎng)禽業(yè)的細菌性傳染病之一，對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重損失，由于當前研究成果不能全面揭示APEC感染禽宿主的致病機制，并且APEC具有血清型多樣性特征，目前沒有有效防控APEC感染禽宿主的疫苗。本文對APEC O2∶K1血清型菌株進行全基因組測序，通過比較基因組分析鑒定APEC基因組特征，對APEC流行毒株進行致病力評價，篩選和鑒定APEC新的毒力因子和轉錄調節(jié)因子，研究結果豐富了對禽致病性大腸桿菌致病機制的認識。
　　1.APE

3、C O2∶K1血清型菌株IMT5155全基因測序及比較基因組學研究
　　本研究首次對APEC O2∶K1血清型毒株IMT5155進行全基因測序，進行比較基因組學研究，分析IMT5155演化關系和基因藍圖，結果表明IMT5155與典型的ExPEC強毒株具有相近的演化關系;通過對IMT5155基因組的毒力島分析，發(fā)現(xiàn)了一個APECO2∶K1血清型菌株特有的基因島，這個新的基因島命名為PAI I5155(GI-12);另外，兩個六型分泌

4、系統(tǒng)(T6SSs)分別位于IMT5155的基因島GI-7和GI-16，并且普遍同時存在于ExPEC O1、O2和O18優(yōu)勢血清型菌株;IMT5155含有兩個質粒，其中大質粒p1ColV5155含有多類毒力因子，其影響APEC的致病力;對B2 ExPEC泛基因組中毒力因子進行分類和基因分布分析，結果表明B2群ExPEC強毒株基因組中部分類型的毒力因子為APEC/ExPEC特有的毒力因子，比如黏附素、侵襲素、毒素和涉鐵系統(tǒng)等;通過4種動物模

5、型對APEC O1∶K1和O2∶K1血清型菌株（中國分離株）進行致病力測定，結果表明這些菌株屬于強毒株，能引起較強的禽大腸桿菌病，并且能引起大鼠乳鼠的腦膜炎，表明APEC O1∶K1和O2∶K1菌株可能具有人畜共患潛力。
　　2.APEC自分泌黏附素AatB的鑒定和功能分析
　　通過比較分析APEC基因組發(fā)現(xiàn)了一個新的APEC自分泌黏附素基因aatB，其堿基序列長度為1017bp，編碼一個36.3kDa的蛋白，對AatB結構

6、預測分析證實其具有典型的AT結構域，包含N端信號肽、膜外功能域和C端β折疊跨膜域，基因分布檢測表明aatB在APEC分離株分布率為26.4％(72/273)，而aatB基因在ECOR D和B2群APEC菌株中分布率較高（接近70％）。本研究構建DE205B aatB的缺失株和互補株，實驗證實aatB的缺失會降低DE205B對DF-1細胞的黏附能力和對雛鴨的致病力(LD50)，并且降低DE205B在雛鴨肺臟內的定殖能力，而aatB互補株的

7、致病力基本恢復至野生株水平，以上實驗結果證實AatB與APEC的致病力有直接相關性，AatB能夠影響APEC對宿主細胞的黏附定殖，并且Western blot證實AatB可以激發(fā)雛鴨產(chǎn)生對應的抗體。另外，生物被膜實驗證實AatB能夠介導無FI菌毛E.coli AAEC189生物被膜的形成能力。
　　3.APEC自分泌黏附素UapB的鑒定和功能分析
　　APEC強毒株DE205B編碼一個典型的傳統(tǒng)AT蛋白UpaB，本研究對該蛋

8、白進行功能鑒定，并構建APEC強毒株DE205B的upaB基因缺失株，結合前期對APEC ATs(AatA和AatB)致病力的研究，構建了基因upaB、aatA和aatB的雙缺失和三缺失菌株。PCR檢測發(fā)現(xiàn)upaB基因在APEC菌株中的分布率為41.9％，并且主要分布于ECOR B2和D群（分布率～70％）;黏附試驗證實UpaB介導DE205B對DF-1 cells的黏附，并且UpaB能提高無菌毛菌株AAEC189的凝集和形成生物被膜的

9、能力;與野生株DE205B相比，upaB、aatA和aatB雙缺失或三缺失菌株顯著降低其對DF-1細胞的黏附能力和對雛鴨早期感染時在肺臟內定殖的能力，伴隨著半數(shù)致死劑量(LD50)的上升;在DE205B△upaB/△aatA/△aatB早期感染階段，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)該菌株的菌毛黏附素基因(yqiL和yadN)及空泡形成毒素基因vat（編碼AT家族蛋白）的轉錄水平明顯高于在體外LB培養(yǎng)時，因此推測在感染過程三缺失菌株DE205B△up

10、aB/△aatA/△aatB試圖通過上調毒力因子(YqiL、YadN和Vat)的表達水平以補償其致病力;實驗證實UapB、AatA和AatB均具有免疫原性，疫苗接種相關蛋白對雛鴨具有一定程度上的免疫保護力，因而ATs(UapB、AatA和AatB)可以作為APEC亞單位疫苗的候選對象。
　　4.轉錄調節(jié)因子AutA/AutR調控禽致病性大腸桿菌感染的分子機制
　　禽致病性大腸桿菌(APEC)通過呼吸系統(tǒng)感染禽類宿主，APEC

11、可以迅速地調整毒力相關因子的表達模式以促進對宿主的感染定殖，在這個感染過程中需要特定的轉錄調節(jié)因子參與APEC毒力因子表達調控。這些受調節(jié)的毒力因子包含自分泌黏附素和K1莢膜，這兩種毒力因子促進APEC黏附定殖于宿主的巨噬/非巨噬細胞，及利于APEC耐受血清殺菌作用。本研究發(fā)現(xiàn)并命名了兩個新發(fā)現(xiàn)的轉錄調節(jié)因子AutA和AutR，基因aurA和autR位于DE205B基因組的UpaB基因簇，基因分布檢測證實UpaB基因簇主要APEC B2

12、和D群分離株。RT-PCR和β半乳糖苷酶試驗證實AutA和AutR共同調控DE205B黏附素UpaB的表達，電泳遷移分析和體外轉錄試驗證實AutA和AutR可以直接與upaB啟動子區(qū)域結合，AutA可以激活upaB轉錄，而AutR通過阻礙AutA的活性來抑制upaB轉錄。不僅如此，轉錄組分析發(fā)現(xiàn)AutA和AutR共同調節(jié)APEC一百多個基因的mRNA轉錄，受調控的基因表達產(chǎn)物包括黏附素、K1莢膜和酸耐受系統(tǒng)等。進一步研究表明，在APEC