抑肽酶-氨甲環(huán)酸改良可注射性纖維蛋白凝膠的體外實(shí)驗(yàn).pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨缺損是臨床的難題之一，關(guān)節(jié)軟骨缺乏自身修復(fù)能力，是臨床上對創(chuàng)傷和關(guān)節(jié)炎所致的軟骨缺損難以取得滿意效果的主要原因。以往人們主要通過自體或異體軟骨移植、軟骨膜或骨膜移植、軟骨細(xì)胞移植等來研究及治療修復(fù)軟骨缺損。而自體關(guān)節(jié)軟骨移植存在來源有限、創(chuàng)傷大、費(fèi)用高等缺點(diǎn)，異體關(guān)節(jié)軟骨移植難以排除免疫源性的問題。隨著組織工程的發(fā)展，利用人工再生組織來修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，為臨床解決這一難題提供了新的思路和方法。雖然關(guān)節(jié)軟骨組織工程的研究已經(jīng)取得了

2、很大進(jìn)展，但仍有大量的問題等待解決。 近年來，隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，尋找具有良好生物相容性和功能仿生性的生物材料正在成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。在致力于合成和開發(fā)出新型生物材料的同時(shí)，人們也立足于對現(xiàn)有生物材料進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能改造，使之能夠最大限度仿生天然組織的成分、結(jié)構(gòu)和功能特征，為細(xì)胞和組織生長提供最佳的生理環(huán)境，實(shí)現(xiàn)理想的功能替代。纖維蛋白基材料包括纖維蛋白原和纖維蛋白，是一種具有良好生物相容性和生物降解性能的天然

3、聚合物材料，早在20世紀(jì)70年代纖維蛋白膠就作為止血?jiǎng)┖头忾]劑而被廣泛應(yīng)用于臨床。后來人們通過對凝血機(jī)制的研究，認(rèn)識到將纖維蛋白原和凝血酶在體外配合并應(yīng)用于臨床可以得到很好的效果。近幾年纖維蛋白基材料用于組織工程支架中，由于纖維蛋白基材料具有良好的生物相容性和生物降解性能，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于開發(fā)各種組織工程支架和生長因子釋放系統(tǒng)。為滿足不同組織工程對支架三維結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能的要求，纖維蛋白基材料可以制成凝膠、黏膠、微珠和納米纖維，也可以單獨(dú)

4、使用或與其他材料復(fù)合。同特定成型的聚合物材料相比，可注射性的生物材料具有可以與細(xì)胞和（或）生長因子均勻混合，與修復(fù)組織之間嵌合連接好，塑型容易的特點(diǎn)，且能通過微創(chuàng)方式操作，治療簡單，安全，有效，另外可注射材料還適合于對細(xì)胞施加壓力使之產(chǎn)生應(yīng)力刺激，因此可注射性的軟骨組織工程產(chǎn)品應(yīng)該是臨床應(yīng)用的發(fā)展方向。 但是纖維蛋白基材料自身的缺點(diǎn)，即降解速率過快和力學(xué)強(qiáng)度不夠等都限制了其更廣泛的應(yīng)用?？梢灶A(yù)見，隨著材料制備和復(fù)合技術(shù)的不斷發(fā)展

5、，纖維蛋白類材料將在組織工程中獲得個(gè)多的應(yīng)用。文章旨在研究通過化學(xué)方法調(diào)節(jié)其不同組分的濃度來控制纖維蛋白凝膠支架的降解率，探討其在組織修復(fù)中的獨(dú)特作用，展望其用于組織工程材料的應(yīng)用前景。 研究目的： 通過在可注射性纖維蛋白凝膠中引入不同濃度的抑肽酶和氨甲環(huán)酸，探索其對纖維蛋白凝膠支架的降解速率及對軟骨細(xì)胞的繁殖、表型的維持、基質(zhì)的分泌產(chǎn)生的影響及影響大小。在纖維蛋白凝膠支架的降解與軟骨細(xì)胞的繁殖、表型的維持、基質(zhì)的分泌之

6、間找到一最佳平衡點(diǎn)，為組織工程方法過渡到臨床做前期工作。 研究方法： 以細(xì)胞和支架材料為實(shí)驗(yàn)對象，以標(biāo)準(zhǔn)組和改良組分組對照。質(zhì)量檢測分組：2個(gè)時(shí)間點(diǎn)：2周、3周。10個(gè)平行孔/組，10個(gè)培養(yǎng)組共200孔。 取3周齡新西蘭幼兔的關(guān)節(jié)軟骨制取軟骨細(xì)胞，體外單層培養(yǎng)、擴(kuò)增后種植于纖維蛋白凝膠支架上，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白凝膠支架細(xì)胞復(fù)合物和不同濃度的抑肽酶（7500KIU/ml、12500 KIU/ml、17500 KIU/

7、ml）及氨甲環(huán)酸（15mg/ml、20mg/ml、25 mg/ml）的改良纖維蛋白凝膠支架細(xì)胞復(fù)合物（實(shí)驗(yàn)分九組，濃度由低到高），進(jìn)行體外三維立體培養(yǎng)、擴(kuò)增6周。觀察軟骨細(xì)胞在纖維蛋白凝膠支架上的形態(tài)變化，比較并觀察加入抑肽酶和氨甲環(huán)酸對軟骨細(xì)胞增殖的影響情況；支架培養(yǎng)1周內(nèi)，行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制生長曲線；于培養(yǎng)第1天行掃描電鏡形態(tài)學(xué)觀察；分別于培養(yǎng)1周及2周后行透射電鏡下的組織形態(tài)學(xué)觀察，復(fù)合物于培養(yǎng)1周、2周后進(jìn)行石蠟包埋、切片，行蘇木

8、精－伊紅染色及Ⅱ型膠原免疫組化檢測，觀察軟骨細(xì)胞的生物學(xué)性狀變化及加入抑肽酶和氨甲環(huán)酸對軟骨細(xì)胞的影響。分別于培養(yǎng)2周及3周后測量纖維蛋白凝膠支架細(xì)胞復(fù)合物質(zhì)量和載體降解情況，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 統(tǒng)計(jì)方法：同一時(shí)間點(diǎn)的各組纖維蛋白凝膠的剩余質(zhì)量比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析（One-way ANOVA），各組之間多重比較用LSD法，全部數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。全部數(shù)據(jù)采用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0．05。 研究結(jié)果： 1．細(xì)胞形態(tài)：初接種時(shí)體外單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞呈球形，懸浮在培養(yǎng)液中，5h后開始貼壁，細(xì)胞呈扁平狀，大多數(shù)三角形，或多角形，有較多突起，部分細(xì)長突起?？缭郊?xì)胞與遠(yuǎn)處的細(xì)胞突起相連結(jié)；胞核呈圓形或橢圓形，居中或偏于一側(cè)，輪廓清晰，可見1～3個(gè)核仁。細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。約1周細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶，呈“鋪路石”樣。第2、3代細(xì)胞S-100免疫細(xì)胞化學(xué)染色胞漿內(nèi)呈陽性反應(yīng)。當(dāng)軟骨

10、細(xì)胞培養(yǎng)4代以后，隨著反復(fù)傳代細(xì)胞逐漸失去二倍體性質(zhì)并發(fā)生轉(zhuǎn)化。細(xì)胞中梭形細(xì)胞增多，胞漿內(nèi)空泡增多，核輪廓模糊，甚至無核仁。細(xì)胞分泌和增殖能力下降，傳代周期延長，以至完全停止。 2．細(xì)胞/支架光鏡下觀察：纖維蛋白凝膠以標(biāo)準(zhǔn)組出現(xiàn)改變較早，標(biāo)準(zhǔn)組于2天后即出現(xiàn)不規(guī)則裂紋，1周后支架各層面已布滿空泡，3周后已大部分崩解，而改良組多于1周后開始出現(xiàn)空泡，且明顯少于標(biāo)準(zhǔn)組，3周后改良組崩解尚不到原體積的1/2，標(biāo)準(zhǔn)組及實(shí)驗(yàn)1、2、4、5

11、組鏡下可見軟骨細(xì)胞在空泡內(nèi)分裂增殖，改良7、8組一周后可見部分細(xì)胞分裂，細(xì)胞呈梭型，類似樹枝樣生長，呈現(xiàn)反分化現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)9組體外培養(yǎng)9天細(xì)胞呈阿米巴樣改變，細(xì)胞分裂相少。改良5組體外培養(yǎng)3周可見軟骨陷窩。 3．細(xì)胞計(jì)數(shù)、繪制生長曲線：種子細(xì)胞和材料復(fù)合后，分別于培養(yǎng)的1～7天行胎盼蘭染色細(xì)胞計(jì)數(shù)并繪制細(xì)胞生長曲線，可以看出改良1、2、4、5組與標(biāo)準(zhǔn)組無明顯差異，而改良3、6、7、8、9組細(xì)胞生長明顯減慢。 4．質(zhì)量檢測：

12、標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白凝膠支架組與所有改良纖維蛋白凝膠支架組體外培養(yǎng)2周及3周后剩余質(zhì)量之間比較均有P<0．001，標(biāo)準(zhǔn)組與所有改良組降解速度有顯著性差異；改良1組與改良2、3、4、5、6、7、8、9組體外培養(yǎng)2周及3周后剩余質(zhì)量之間比較P<0．05，改良1組與改良2、3、4、5、6、7、8、9組降解速度有顯著性差異；改良5組與改良3、6、7、8、9組比較P>0．05，改良5組與改良3、6、7、8、9組降解速度無顯著性差異；改良5組與改良1、2、

13、4組比較P<0．05，改良5組與改良1、2、4組降解速度有顯著性差異；改良纖維蛋白凝膠支架細(xì)胞組在體外4周的培養(yǎng)過程中僅有少量崩解，標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白凝膠支架細(xì)胞組則完全崩解。 5．掃描電鏡及透射電鏡：培養(yǎng)第1天掃描電鏡下可見軟骨細(xì)胞黏附于纖維蛋白膠內(nèi)呈三維空間生長；培養(yǎng)1周、2周及3周后，標(biāo)準(zhǔn)組及改良1、5組等中、低濃度組透射電鏡下可見基質(zhì)的外分泌。而3、6、7組等高濃度組透射電鏡下可見基質(zhì)的外分泌明顯減少，改良9組甚至未見基質(zhì)的分

14、泌。 6．HE染色和免疫組化結(jié)果：HE染色可見標(biāo)準(zhǔn)組及改良1、2、4、5組1周及2周，支架內(nèi)部可見細(xì)胞聚集成團(tuán)，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞團(tuán)中有基質(zhì)分泌，沉積于細(xì)胞周圍，Ⅱ型膠原免疫組化檢測可見空泡內(nèi)軟骨細(xì)胞周圍均出現(xiàn)陽性棕色顆粒。改良3、6、7、8組Ⅱ型膠原免疫組化檢測軟骨細(xì)胞周圍棕色顆粒較少。改良9組軟骨細(xì)胞周圍未見棕色顆粒。 結(jié)論： 1．纖維蛋白凝膠具有良好的生物相容性，且免疫原性低。單純纖維蛋白凝膠中細(xì)胞生

15、長未見明顯異常，細(xì)胞的增殖、表型維持及分泌功能正常。 2．通過在纖維蛋白凝膠中引入不同濃度的抑肽酶和氨甲環(huán)酸，在體外環(huán)境下均可以顯著地減緩纖維蛋白膠的降解速度，濃度的高低與纖維蛋白凝膠支架的降解速率成反比。通過調(diào)節(jié)纖維蛋白凝膠中抑肽酶和氨甲環(huán)酸的濃度，可實(shí)現(xiàn)對纖維蛋白凝膠降解速度的調(diào)控。 3．不同濃度的抑肽酶和氨甲環(huán)酸對軟骨細(xì)胞的增殖和表型的維持有一定的影響。高濃度抑肽酶和氨甲環(huán)酸的加入明顯抑制了細(xì)胞的增殖，使軟骨細(xì)胞呈