可注射性纖維蛋白凝膠-脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合支架修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨的實驗研究.pdf

1、骨性關(guān)節(jié)炎是臨床上常見的一種關(guān)節(jié)炎，其發(fā)病與增齡、外傷和力的承受、肥胖、遺傳以及性別等有關(guān)。病理改變表現(xiàn)為軟骨的破壞和修復(fù)并存，關(guān)節(jié)囊增厚，病變骨質(zhì)粘連，滑膜炎血管增厚和局灶性出血以及關(guān)節(jié)附近骨質(zhì)囊性變。關(guān)節(jié)機(jī)械力分布失衡、負(fù)荷過度后，出現(xiàn)軟骨磨損及軟骨細(xì)胞代謝異常，軟骨細(xì)胞釋放溶酶體和膠原蛋白酶，導(dǎo)致膠原蛋白網(wǎng)斷裂。軟骨破壞的同時也伴有修復(fù)過程，但由于新合成的細(xì)胞外基質(zhì)異常，新合成的軟骨很快降解破壞，滑膜產(chǎn)生的炎癥因子反過來加速軟骨的

2、破壞，如此反復(fù)循環(huán)，軟骨消耗殆盡，臨床上出現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎的癥狀。
　　 由于關(guān)節(jié)軟骨無血運、無神經(jīng)支配、無淋巴管，軟骨細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，軟骨細(xì)胞被包裹在軟骨陷窩內(nèi)限制了軟骨細(xì)胞的遷移，同時滑膜細(xì)胞數(shù)量少、生物活性有限，因此，軟骨一旦損傷后修復(fù)能力極低，甚至被認(rèn)為是不能再生的組織(Hunter,1743)。目前的研究表明，在特定的條件及環(huán)境中，軟骨修復(fù)是可以實現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)若軟骨缺損的撕裂部位靠近軟骨下骨或骨髓，引起血管出血，則軟

3、骨修復(fù)再生即可發(fā)生。出血導(dǎo)致血腫和纖維蛋白凝塊形成，并進(jìn)一步促進(jìn)與骨發(fā)生有關(guān)的細(xì)胞因子及蛋白的聚集。接下來的2-5天內(nèi)，諸如間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等祖細(xì)胞從周圍的軟骨、骨、骨髓、滑膜等組織向受損初遷移來維持軟骨修復(fù)。其后的一周，血凝塊的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)成為干細(xì)胞的支架，充填缺損部位。
　　 自從1965年Smith成功分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞以后，以體外支架培養(yǎng)軟骨種子細(xì)胞后移植體內(nèi)為特點的軟骨組織工程的研究便逐漸開展。1987年美國

4、科學(xué)基金會在華盛頓舉辦的生物工程小組會上提出了“組織工程”這個名詞，1988年被定義為“應(yīng)用生命科學(xué)與工程科學(xué)的原理和方法，在可控、可重復(fù)的條件下，通過哺乳動物、人類(包括患者本身)特定細(xì)胞在網(wǎng)絡(luò)構(gòu)架上的體外培養(yǎng)及體內(nèi)移植，形成具有特定功能的組織和生物替代物”。特別是最近10余年，軟骨組織工程取得長足進(jìn)步并逐漸顯示其修復(fù)軟骨缺損的優(yōu)越性。
　　 生物工程支架必須具備以下屬性：可降解、生物相容性、表面積/體積比、機(jī)械強(qiáng)度以及神經(jīng)、

5、血管可滲透性。骨軟骨組織工程支架還需具備一定的機(jī)械強(qiáng)度，并能夠釋放促進(jìn)骨與軟骨再生的活性物質(zhì)。同樣的，作為種子細(xì)胞貼附、遷移以及分化基礎(chǔ)的相互交聯(lián)的微孔樣結(jié)構(gòu)也是支架不可或缺的評價指標(biāo)。目前的生物載體材料中的天然材料主要包括膠原和纖維蛋白凝膠。纖維蛋白凝膠及脫鈣骨基質(zhì)都有優(yōu)良的生物相容性及生物降解性，因此可以作為軟骨組織工程支架培養(yǎng)軟骨種子細(xì)胞。這兩種材料分別可以作為生長因子的載體緩慢釋放生長因子，并達(dá)到持續(xù)發(fā)揮促軟骨細(xì)胞生長的功能。<

6、br>　　 纖維蛋白凝膠以及脫鈣骨基質(zhì)均具備作為支架材料培養(yǎng)軟骨種子細(xì)胞的基本條件，生物相容性、可降解性等均較好，而且具備作為生長因子載體緩慢保存并緩慢釋放的功能。纖維蛋白凝膠具有較大的表面積/體積比，孔隙率較大，一方面通過較大附著面積促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖、分化，另一方面促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)在支架與周圍組織的細(xì)胞間運輸。通過加入氨甲環(huán)酸減慢其降解速度，達(dá)到材料的降解和軟骨組織的形成同步化。并有DBM在降解同時緩慢釋放其成軟骨活性物質(zhì)，促進(jìn)了軟骨

7、組織的形成。
　　 目的：本實驗研究了纖維蛋白凝膠/脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合支架作為軟骨組織工程支架的可行性及有效性。并且進(jìn)一步研究了該種復(fù)合支架能否作為可注射性復(fù)合支架修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷。
　　 方法：
　　 1.分離并提取兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)與傳代。
　　 2.取第三代軟骨細(xì)胞接種于復(fù)合支架體外培養(yǎng)四周。
　　 3.移植復(fù)合支架/軟骨細(xì)胞至兔膝關(guān)節(jié)髁間窩軟骨缺損處，分別于第4周、第8周以及第12

8、周取材。
　　 4.制作兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型。
　　 5.大體觀察修復(fù)情況。
　　 6.標(biāo)本切片HE染色。
　　 7.Masson染色。
　　 8.Ⅱ型膠原免疫組化染色。
　　 9.Wakitani評分，觀察其體內(nèi)修復(fù)關(guān)節(jié)缺損效果。
　　 10.向切除了前交叉韌帶及半月板的兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射復(fù)合支架/軟骨細(xì)胞。并于第12周取材。
　　 11.制定新的綜合評分標(biāo)準(zhǔn)，評估骨性關(guān)節(jié)炎

9、組織學(xué)改變。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功提取軟骨細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
　　 2.成功制作兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型。
　　 3.軟骨細(xì)胞在復(fù)合支架中呈球狀，并在DBM微粒周圍更多分布。
　　 4.透明軟骨樣組織從支架移植修復(fù)第4周開始充填缺損部，并在第12周可見到修復(fù)組織與周圍正常軟骨組織無異，表面光滑，顏色半透明。光鏡下于第8周可見明顯軟骨陷窩，第12周時，Ⅱ型膠原明顯多于第4、8周。