可注射性磷酸鈣復(fù)合纖維蛋白膠人工骨的研制及其性能.pdf

1、研究目的：研究纖維蛋白膠復(fù)合β-TCP/MCPM骨水泥復(fù)合物的物理學(xué)性能，評(píng)價(jià)纖維蛋膠對(duì)β-TCP/MCPM胃水泥性能的影響。通過對(duì)β-TCP/MCPM磷酸鈣骨水泥復(fù)合纖維蛋白膠人工骨物進(jìn)行體內(nèi)生物安全性實(shí)驗(yàn)研究，探討β-TCP/MCPM磷酸鈣骨水泥復(fù)合纖維蛋白膠人工骨用于骨缺損修復(fù)的可行性，指導(dǎo)臨床用于骨缺損的修復(fù)應(yīng)用。 研究方法： (1)生物材料理學(xué)性能測(cè)試 1、凝結(jié)時(shí)間的測(cè)定采用吉爾摩針法，即用兩支質(zhì)量分別

2、為113和445g，針尖直徑分別為2.1和1.1mm的吉爾摩粗細(xì)針進(jìn)行測(cè)試。以不被粗細(xì)針留下刺痕的時(shí)間分別為初凝和終凝時(shí)間。 2、β-TCP/MCPM的抗稀散性取β-TCP/MCPM和β-TCP/MCPM＋FG組骨水泥混合物分別制成小球后，立即置入生理鹽水或蒸餾水(37°)中24h，通過肉眼觀察表面稀散情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，再放入搖床中稍震蕩看骨水泥小球是否會(huì)有甭解。 3、生物力學(xué)樣本的制備及測(cè)試稱取適量骨水泥粉末，按β-TCP

3、/MCPM與檸檬酸(或檸檬酸鈉)固液比為1g/0.3ml，混勻后按2.5:1的體積比加入纖維蛋白膠，填入標(biāo)準(zhǔn)模具中(內(nèi)徑8mm，高度16mm)，表面摸平后即脫模，37℃，接近100％濕度條件下將試樣養(yǎng)護(hù)72h后，標(biāo)示保存：另取單純?chǔ)?TCP/MCPM粉末按固液比為1g/0.5ml制成標(biāo)準(zhǔn)樣品做為對(duì)照，取上述磷酸鈣骨水泥試樣用電子式萬能材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行抗壓強(qiáng)度的測(cè)試，計(jì)算材料的抗壓強(qiáng)度。 4、掃描電鏡觀察將β-TCP/MCPM，β-

4、TCP/MCPM＋FG組材料完全干燥后制成自然斷裂樣本，樣本斷裂面經(jīng)真空鍍膜儀表面噴金，掃描電鏡不同放大倍數(shù)下觀察FG與β-TCP/MCPM混合后樣本結(jié)構(gòu)特征，測(cè)量材料的孔徑，及兩者材料有無差別。另取β-TCP/MCPM＋FG復(fù)合材料的部分?jǐn)嗔褬颖?，在高溫電爐800℃下煅燒8h，經(jīng)真空鍍膜表面噴金后，掃描電鏡觀察樣本的結(jié)構(gòu)特征及孔徑的大小，并計(jì)算材料的空隙率。 5、X線衍射(XRD)分析將β-TCP/MCPM粉末與檸檬酸鈉溶液按

5、固液比為1:0.5(g:ml)混合后置于37℃，100％濕度下四周，然后用丙酮浸泡1h，真空干燥，采用XRD分析儀測(cè)試化學(xué)成分。 (2)、生物相容性及安全性實(shí)驗(yàn) ①急性毒性實(shí)驗(yàn)：取體重20±2g的昆明種小鼠，分為材料浸提液原液組和生理鹽水組，分別靜脈注射浸提液原液和生理鹽水，每只注射量1ml。注射24h、48h和72h后稱量小鼠體重，并觀察反應(yīng)。 ②溶血試驗(yàn)：將新鮮抗凝人血用生理鹽水稀釋成2％人血懸液。在不同的試

6、管中分別加入材料生理鹽水浸提液原液組、生理鹽水(陰性對(duì)照)和雙蒸水(陽性對(duì)照)2mL。再在每管分別加入2％新鮮健康人血懸液2mL，37℃水浴1h，肉眼觀察有無溶血。1000r/min離心5min。取上清液1mL，加入0.1％Na2CO3溶液4mL，在752型分光光度計(jì)540nm處測(cè)定各樣本光密度并計(jì)算溶血率。 ③微核試驗(yàn)：取健康昆明種小鼠，體重25～30g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組；其中3組分別腹腔注射不同劑量的β-TCP/MCP

7、M生理鹽水浸提液(0.1，0.2，0.4ml)，另2組為陰性對(duì)照組(生理鹽水)和陽性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺100mg/kg)。采用四次給藥法，分別間隔24h，于第四次給藥后6h處死動(dòng)物。取股骨髓制片，瑞特氏(Wright)染色。在油鏡下計(jì)數(shù)，每只動(dòng)物觀察1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞中含含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核細(xì)胞率。 ④細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3成骨細(xì)胞株經(jīng)胰酶消化制成密度為5×104ml的細(xì)胞懸液，分別接種于96孔培養(yǎng)板

8、上，每孔100ul，每組5孔。培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁，棄培養(yǎng)液，加入不同濃度的DMEM/F-12浸提液(原液組，50％原液組，10％原液組)，單純培養(yǎng)液組為陰性對(duì)照，含0.64％苯酚的培養(yǎng)液組為陽性對(duì)照。置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24，48，72h后取出，每孔加入0.5％MTT20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄培養(yǎng)液，加入二甲亞砜150ul/孔，震蕩5min，酶標(biāo)儀490nm下測(cè)定每孔0D值。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。 研究結(jié)果：

9、 1.凝固時(shí)間 結(jié)果顯示添加纖維蛋白膠后可明顯延長(zhǎng)該復(fù)合骨水泥材料的初步凝結(jié)時(shí)間和終凝時(shí)間，終凝時(shí)間較初凝時(shí)間延遲2～4秒。 2.抗稀散性能 兩者剛投入生理鹽水中材料都無崩解，24小時(shí)后β-TCP/MCPM/FG材料表面仍保持較完整，無明顯潰散現(xiàn)象。對(duì)照組β-TCP/MCPM較實(shí)驗(yàn)組有明顯潰散，材料不完整。 3.生物力學(xué)測(cè)試 單純?chǔ)?TCP/MCPM和β-TCP/MCPM/FG組骨水泥材料的抗壓強(qiáng)度分別為19.6

10、3±1.98MPa和14.72±1.81MPa。 4.XRD通過與JCPDF標(biāo)準(zhǔn)卡片對(duì)照，兩種樣品的XRD譜線與標(biāo)準(zhǔn)的HAP的XRD譜線一致，其主峰位于XRD譜線32°附近，說明兩種樣品具有相同的結(jié)晶相，加入FG并沒有新的相產(chǎn)生，同純?chǔ)?CP/MCPM樣品一樣，主要轉(zhuǎn)化為HAP。 5.掃描電鏡觀察掃描電鏡見β-TCP/MCPM由規(guī)則的短棒狀晶體和扁平狀晶體構(gòu)成，晶體互相連接附著，晶體間充滿不規(guī)則的微孔，微孔大小約(2～3

11、um)空隙率約為46.84％。復(fù)合材料內(nèi)FG貫穿于β-TCP/MCPM晶體間，將β-TCP/MCPM晶體緊密連接。晶體間的微孔大小約為(2～5um)空隙率約為48.06％。高溫煅燒后見復(fù)合材料內(nèi)微孔的孔徑較煅燒前有增大，微孔的直徑約為(2～7um)空隙率約為57.58％，且有延伸的溝隙將β-TCP/MCPM微孔相連。 6.全身急性毒性試驗(yàn)分析：結(jié)果浸提液組小鼠的平均體重在注射后24、48、72h后的變化與生理鹽水組的基本一致，并

12、且小鼠在注射浸提液后也未出現(xiàn)死亡或昏迷、呼吸抑制、呼吸困難、四肢活動(dòng)受限等中毒反應(yīng)，這表明該復(fù)合人工骨材料沒有急性全身毒性。 7.溶血試驗(yàn)結(jié)果肉眼下觀察示各實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組無明顯溶血，陽性對(duì)照組可見有明顯溶血，各實(shí)驗(yàn)組的溶血率均未超過5％，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。 8.微核試驗(yàn)各組動(dòng)物股骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，試驗(yàn)組微核率與陰性對(duì)照組差異無顯著性；陰性對(duì)照組微核率與陽性對(duì)照組差異有顯著性。說明新型復(fù)合人工骨材料的浸提

13、液無細(xì)胞遺傳毒性作用。 9.細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果示各實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組小鼠MC3T3成骨細(xì)胞狀態(tài)生長(zhǎng)分化良好，細(xì)胞保持梭形，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞密度較高，多為長(zhǎng)梭形和多角形并見圓形分裂狀態(tài)細(xì)胞，陽性對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)分化停止，細(xì)胞變類圓形縮小，出現(xiàn)較多漂浮狀死細(xì)胞。酶標(biāo)儀測(cè)試各組吸光度值及相對(duì)增殖率(RGR)值，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)MC3T3成骨細(xì)胞株的細(xì)胞毒性均為I級(jí)，對(duì)照組為IV～V。 結(jié)論： 1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該復(fù)合材料的具有合

14、適的凝固時(shí)間和較好的抗稀散性能；可加速β-CP/MCPM自身的降解，加入纖維蛋白膠后的復(fù)合材料的抗壓強(qiáng)度達(dá)到松質(zhì)骨強(qiáng)度的要求，滿足用于非承重骨缺損的充填加入纖維蛋白膠煅燒后CPC的空隙率明顯提高，可見隨著FG的降解，空隙率將逐漸增大，有利于材料的降解，利于新骨的長(zhǎng)入，促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。 2.該新型復(fù)合纖維蛋白膠的磷酸鈣人工骨材料具有良好的生物相容性和生物安全性，達(dá)到生物相容性和生物安全性要求，基本滿足作為注射型人工骨材料用于臨床