RNA干擾沉默TGFβRI基因?qū)τ信叻纬衫w維細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建針對轉(zhuǎn)化生長因子βⅠ型受體(TGFβRⅠ)的RNA干擾(RNAi)慢病毒載體，通過感染人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC-5，觀察TGFβRⅠ表達(dá)受抑制后，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)對MRC-5細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、活化、膠原表達(dá)以及炎性因子(TNF-α)釋放的影響。
　　方法：(1)根據(jù)人TGFβRⅠ基因編碼序列設(shè)計(jì)4個(gè)小干擾序列和1個(gè)陰性對照序列，BLAST驗(yàn)證基因同源性。將設(shè)計(jì)的干擾序列合成相應(yīng)的寡核苷酸DNA，退火形

2、成雙鏈后與經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pMagic4.0/EGFP載體連接，PCR行陽性克隆篩選并予以測序鑒定，然后進(jìn)行慢病毒包裝。(2)將4對TGFIβRⅠ-siRNA重組慢病毒載體和1對陰性對照慢病毒載體感染體外培養(yǎng)的MRC-5細(xì)胞，感染48h和72h后分別采用Real time PCR和Western blot檢測TGFβRⅠ mRNA和蛋白表達(dá)。(3)將干擾效率最高的TGFβRⅠ-siRNA慢病毒和陰性對照慢病毒感染MRC-5細(xì)

3、胞48h，之后實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組：CON組(MRC-5予以DMEM正常培養(yǎng))，T組(MRC-5予以5ng/ml TGF-β1刺激)，NC+T組(感染陰性對照慢病毒的MRC-5予以5ng/ml TGF-β1刺激)和RNAi+T組(感染TGFβRⅠ-siRNA慢病毒的MRC-5予以5ng/ml TGF-β1刺激)。采用MTT法觀察各組細(xì)胞的增殖狀態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時(shí)相分布，天狼猩紅染色法測定細(xì)胞內(nèi)總膠原含量，RT-PCR檢測各組細(xì)胞α-

4、SMA的mRNA表達(dá)情況，ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中TNF-α表達(dá)水平。
　　結(jié)果：(1)經(jīng)PCR鑒定以及測序結(jié)果證實(shí)，成功構(gòu)建TGFβRⅠ基因特異性siRNA慢病毒載體。(2)N置熒光顯微鏡顯示各感染組細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOI)為30、加入Polybrene5ng/ml時(shí)，MRC-5細(xì)胞感染病毒的效率達(dá)93％。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，TGFβRⅠ-siRNA1～4感染組TGFβRⅠ mRNA表達(dá)

5、水平較正常對照組分別下降了26.8％、80.8％、70.7％和79.7％(P<0.05)，其中以TGFβRⅠ-siRNA2的干擾效率最高。Western blot檢測結(jié)果顯示抑制TGFβRⅠ蛋白表達(dá)下降趨勢與Real-time PCR結(jié)果一致。(3)MTT法和流式細(xì)胞儀檢測顯示，與其他各組比較，RNAi+T組細(xì)胞增殖受到顯著抑制，RNAi可使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，進(jìn)入S期細(xì)胞比例減少(P<0.05)，而其他三組之間細(xì)胞的增殖能力和

6、周期分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。(4)天狼猩紅染色法檢測顯示，與CON組比較，T組和NC組則細(xì)胞內(nèi)膠原表達(dá)明顯增加(P<0.05)；RNAi+T組與T組比較，細(xì)胞內(nèi)總膠原表達(dá)明顯降低(P<0.05)。(5)RT-PCR檢測顯示，與CON組比較，T組和NC組細(xì)胞內(nèi)α-SMA mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，而與T組比較，TGFβRⅠ基因RNAi能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)α-SMA mRNA表達(dá)(P<0.05)。(6)ELISA檢測顯示

7、T組細(xì)胞上清液中TNF-α含量高于CON組(P<0.05)，RNAi+T組則可降低TGF-β1刺激后細(xì)胞TNF-α的濃度升高(P<0.05)。
　　結(jié)論：(1)針對TGFβRⅠ基因特異性siRNA慢病毒載體能夠顯著抑制靶基因的表達(dá)；(2)抑制TGFβRⅠ基因表達(dá)后，MRC-5細(xì)胞增殖受抑制，細(xì)胞內(nèi)DNA合成下降，其生長停滯于G0/G1期；(3)慢病毒介導(dǎo)的TGFβRⅠ基因RNAi能夠抑制TGF-β1刺激引起的MRC-5細(xì)胞活化、膠