RNA干擾對系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞CTGF表達(dá)、膠原Ⅰ、Ⅲ合成的影響.pdf

1、第一部分：CTGF-siRNA的體外轉(zhuǎn)錄合成及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率的研究 目的研究針對結(jié)締組織生長因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)的特異性小干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)的體外轉(zhuǎn)錄合成及其對系統(tǒng)性硬皮病(SystemicSclerosis，SSC)成纖維細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率。 方法取SSC患者皮膚進(jìn)行成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，用角蛋白和波形蛋白染色進(jìn)行成纖維

2、細(xì)胞的鑒定。設(shè)計(jì)四個(gè)針對CTGF的特異性siRNA及一個(gè)非特異性siRNA；體外轉(zhuǎn)錄獲得siRNA；并用熒光素FAM標(biāo)記；用轉(zhuǎn)染試劑siPORTAmine將siRNA轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。 結(jié)論用體外轉(zhuǎn)錄法合成siRNA簡易、高效，便于siRNA的篩選；使用專門的轉(zhuǎn)染試劑盒不但操作簡便，且能使siRNA得到高效轉(zhuǎn)染。 第二部分：CTGF-siRNA對SSC成纖維細(xì)胞CTGF表達(dá)的影響

3、 目的研究CTGF-siRNA所誘導(dǎo)的RNA干擾對SSC成纖維細(xì)胞CTGFmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。 方法CTGF-siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，分別用半定量RT-PCR(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction)、real-timeRT-PCR法檢測CTGFmRNA的表達(dá)并用Western-blot檢測CTGF蛋白量的變化。 結(jié)論siRNA742等四個(gè)CTGF-siR

4、NA能顯著抑制SSC成纖維細(xì)胞CTGF的表達(dá)。 第三部分：CTGF-siRNA對SSC成纖維細(xì)胞膠原Ⅰ、Ⅲ合成的影響 目的利用體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA研究CTGF在SSC成纖維細(xì)胞膠原Ⅰ、Ⅲ合成中的作用。 方法siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用半定量RT-PCR法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測SSC成纖維細(xì)胞COLⅠA1、COLⅢA1mRNA的表達(dá)和膠原Ⅰ、Ⅲ蛋白含量的變化。 結(jié)論SSC成纖維細(xì)胞內(nèi)CTGFmRNA的表達(dá)