轉(zhuǎn)RNA干涉Myostatin基因小鼠成纖維細(xì)胞的篩選.pdf

1、肌肉抑制素基因(Myostatin,MSTN)屬TGF-β超家族,是肌肉細(xì)胞的自分泌因子,主要在動(dòng)物骨骼肌中特異性表達(dá)并對(duì)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育起到負(fù)調(diào)控作用,因此人工敲低MSTN基因表達(dá)可以有效促進(jìn)成肌細(xì)胞分化為成熟肌纖維,使得肌肉組織量增加。本研究將干涉MSTN基因的shRNA序列與骨骼肌特異性啟動(dòng)子相連構(gòu)建。RNA干涉載體并轉(zhuǎn)染小鼠皮膚成纖維細(xì)胞,通過(guò)G418篩選含有neo抗性基因的轉(zhuǎn)RNA干涉MSTN基因陽(yáng)性細(xì)胞。為進(jìn)一步通過(guò)體細(xì)胞核移

2、植獲得敲低MSTN蛋白基因的轉(zhuǎn)基因鼠奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果與結(jié)論如下:
　　 1、小鼠肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的克隆:參照GenBank中序列(BC105674),采用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù),克隆小鼠肌肉生長(zhǎng)抑制素基因,將其連接到pcDNA3.1(+)載體,獲得肌肉抑制素基因真核表達(dá)載體；
　　 2、RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建:參照肌肉抑制素基因的mRNA序列,設(shè)計(jì)符合“Tuschl”法則的siRNA,并將其以shRNA的序列方式連接到

3、pRNAT-U6干涉載體,獲得RNA干涉表達(dá)載體。將上述干涉載體和肌肉抑制素基因真核表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染進(jìn)293GP細(xì)胞中,利用Real-Time PCR儀檢測(cè)干涉效率,獲得干涉效率最高的siRNA序列；
　　 3、骨骼肌特異RNA干涉載體的構(gòu)建:本研究采用人工合成啟動(dòng)子SP作為特異性啟動(dòng)子替換RNAi載體中U6啟動(dòng)子,獲得骼肌特異性啟動(dòng)的RNA干涉載體。
　　 4、成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選:采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染線性化的RN

4、A干涉表達(dá)載體于小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中,利用G418篩選獲得neo基因的抗性細(xì)胞;
　　 5、對(duì)neo基因抗性細(xì)胞的鑒定:對(duì)G418篩選獲得的抗性細(xì)胞,采用PCR方法鑒定表明所構(gòu)建的載體整合到細(xì)胞基因組中,并對(duì)獲得的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞生物特性檢測(cè)。與此同時(shí),將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞冷凍后復(fù)蘇,再次測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。以上結(jié)果均顯示細(xì)胞曲線符合一般規(guī)律,轉(zhuǎn)基因及冷凍未對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重影響。
　　 綜上所述,采用上述方法,獲得轉(zhuǎn)RNA干涉MS