γ干擾素聯(lián)合甲強(qiáng)龍對人胚肺成纖維細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：觀察γ干擾素(IFN-γ)聯(lián)合甲強(qiáng)龍(M-pred)對人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)增殖、膠原合成及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)蛋白與mRNA表達(dá)的影響，旨在通過研究IFN-γ與M-pred聯(lián)合應(yīng)用的體外實(shí)驗(yàn)探討兩藥聯(lián)合應(yīng)用對肺間質(zhì)性疾病的治療效果，為臨床治療提供理論依據(jù)。 方法：將HELF于37℃，5％CO2，飽和濕度條件下，含10％新生牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml的RPMI1640培養(yǎng)液中傳代

2、培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。采用2×4析因設(shè)計(jì)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，按M-pred(0，15μg/ml)和IFN-γ(0，250，500，750U/ml)分為A～H8個(gè)組，A組：M-pred0μg/ml+IFN-γ0U/ml，即對照組；B組：M-pred15μg/ml，即M-pred單獨(dú)應(yīng)用組；C～E組為不同濃度IFN-γ單獨(dú)應(yīng)用組，分別為：IFN-γ250U/ml、500U/ml、750U/ml；F～H組為M-pred與不同濃

3、度IFN-γ聯(lián)合應(yīng)用組，分別為：M-pred15μg/ml+IFN-γ250U/ml，M-pred15μg/ml+IFN-γ500U/ml，M-pred15μg/ml+IFN-γ750U/ml。藥物作用于HELF48h后，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)： 1.應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)法觀察HELF的抑制率：將細(xì)胞以1×105/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板，加入藥物，經(jīng)MTT處理，二甲基亞楓終止反應(yīng)。分別測定各組570nm波長處吸光值(A值)，計(jì)算細(xì)胞

4、抑制率。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)情況：細(xì)胞爬片，加入藥物作用48h后，經(jīng)過固定，抗原修復(fù)，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，及非特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)后，加入一抗，小鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原單克隆抗體(用PBS代替一抗作為陰性對照)；二抗，生物素化的山羊抗鼠IgG抗體，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光鏡下每組隨機(jī)觀察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，分別計(jì)算各組細(xì)胞表

5、達(dá)陽性比率。圖象分析系統(tǒng)處理，計(jì)算各組陽性細(xì)胞平均光密度值。 3.用堿水解法測定培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量代表HELF膠原合成變化：分別收取各組培養(yǎng)液0.5ml，按羥脯氨酸試劑盒操作說明處理后，測定各組550nm波長處吸光值，計(jì)算羥脯氨酸含量。 4.半定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測TGF-β1mRNA表達(dá)變化：用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用隨機(jī)引物、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝

6、膠上進(jìn)行電泳，EB染色，應(yīng)用讀膠儀讀取各擴(kuò)增條帶的積分光密度值(IOD)，以目標(biāo)基因與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的積分光密度值的比值計(jì)算相對表達(dá)水平。 5.用Western印跡技術(shù)觀察TGF-β1蛋白表達(dá)情況：每組樣本收集細(xì)胞1×108個(gè)，PBS洗滌后，裂解，提取細(xì)胞胞漿蛋白。考馬斯亮蘭測定蛋白濃度。每梳孔加100μg樣品蛋白。經(jīng)凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。封閉1h，加入第一抗體，4℃過夜。加入第二二抗體，孵育1h，利用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)

7、行顯色反應(yīng)，數(shù)字圖像分析系統(tǒng)照相并讀取各條帶的積分光密度值(IOD)。 以上結(jié)果應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行析因設(shè)計(jì)的方差分析，取p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：M-pred及IFN-γ均可抑制HELF增殖，具有降低其膠原合成及TGF-β1蛋白與mRNA表達(dá)作用；兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，對膠原合成及TGF-β1蛋白與mRNA表達(dá)的抑制作用隨IFN-γ濃度增加而增強(qiáng)。IFN-γ與M-pred聯(lián)合應(yīng)用治