家蠶傳染性軟化病病毒翻譯起始機制的研究.pdf

1、家蠶軟化病是一類嚴重影響蠶業(yè)生產(chǎn)的病害，家蠶傳染性軟化病病毒(Bombyx mori infectious flacherie virus，BmIFV)作為導致該病的重要病原之一，曾引起國內(nèi)外學者的廣泛關注。BmIFV是一種正義單鏈小RNA病毒，專一寄生家蠶中腸組織的杯狀細胞，被歸入小RNA病毒目(Picornavirales)傳染性軟化病毒科(Iflaviridae)傳染性軟化病毒屬（Iflavirus）。
　　 本研究通過運

2、用生物信息學分析BmIFV結構蛋白前的5'端序列發(fā)現(xiàn):其5'端序列具有多個同框的起始密碼子AUG（具有相同的終止密碼子）且5'端序列的前端與具有內(nèi)部核糖體進入位點（Internal ribosome entry site，IRES）功能的榕透翅毒蛾病毒（Perina nuda virus，PnV）的序列結構十分相似，而其后端與小RNA病毒Ⅱ型的IRES結構十分相似。通過構建含有雙熒光蛋白基因和雙熒光素酶基因的兩類重組桿狀病毒表達系統(tǒng)，驗

3、證不同長度的BmIFV5'端序列的IRES功能。結果證實:BmIFV不同長度的5'端片段具有不同的IRES活性，其中1-155 nt片段的IRES介導下游外源基因的翻譯活性最低，而1-599nt片段的IRES介導外源蛋白的翻譯活性最高。
　　 利用構建的含有雙熒光蛋白的重組桿狀病毒vR-IFV599-G侵染四種鱗翅目昆蟲細胞系（BmN細胞系、Sf9細胞系、Tn細胞系和SL細胞系），結果發(fā)現(xiàn)BmIFV IRES介導的下游外源基因能

4、夠在BmN、Sf9和Tn細胞系中表達;SL細胞系中，BmIFV IRES介導和帽子結構介導的下游外源基因均未表達，經(jīng)Dot blotting分析發(fā)現(xiàn)在添加重組病毒vR-IFV599-G的SL細胞中，未雜交到EGFP的mRNA，由此推測所構建的重組桿狀病毒未侵染SL細胞或多角體啟動子未能在SL細胞中被激活，導致EGFP的mRNA未轉錄。進而證實BmIFV的IRES功能在BmN、Sf9和Tn細胞系中無種屬特異性。
　　 構建含有雙熒

5、光蛋白的重組桿狀病毒vR-IFV599-G侵染5齡起蠶發(fā)現(xiàn):被重組病毒侵染的家蠶全身都具有紅色和綠色熒光。對被感染家蠶的4種組織（中腸、絲腺、脂肪體和表皮）進行Western blotting分析發(fā)現(xiàn):4種組織中均具有紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白的雜交條帶出現(xiàn)，說明BmIFV的IRES介導的下游外源基因的表達在家蠶中無組織特異性。這與BmIFV特異性的侵染家蠶中腸組織杯狀細胞的特性有差異，說明BmIFV侵染的特異性與其翻譯的特性無關，可能

6、與其侵染受體的特異性或復制的特異性有關。
　　 根據(jù)BmIFV的5'端序列設計5條siRNA序列(siRNA-Loop4、siRNA-Loop7、siRNA-Loop8、siRNA-Loop12和siRNA-Loop15)，通過瞬時轉染的方法，將5條siRNA轉染到BmN細胞中，再用重組桿狀病毒vR-IFV599-F接種侵染細胞，發(fā)現(xiàn)RN Ai-Loop15可顯著抑制BmIFV IRES介導的下游的螢火蟲熒光素酶基因的表達。進而