豚鼠膽色素結石模型的腸道免疫屏障研究.pdf

1、前言: 隨著近年來對腸粘膜屏障功能了解的不斷深入，其在多種疾病中的作用愈來愈引起人們的重視。越來越多的證據(jù)表明，腸粘膜屏障功能的異常及其繼發(fā)的細菌移位，參與了多種疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理過程。在近期對膽色素結石的研究工作中注意到，飲食誘導的敘利亞金黃地鼠和豚鼠膽囊膽色素結石形成過程中，腸道屏障功能可能存在異常，研究發(fā)現(xiàn)誘導成石模型的腸道通透性相對良好，腸粘膜機械屏障部分破壞。因此可以提出假設，腸粘膜的生物屏障和免疫屏障是否也同時存

2、在改變，腸道粘膜免疫和生物屏障功能異常是否在膽色素結石形成的某些環(huán)節(jié)中也發(fā)揮一定作用呢?選用較常用的致石食譜誘導的豚鼠膽囊膽色素結石動物模型來進行觀察。沿著腸屏障功能異常-細菌移位-膽汁酶學改變-膽色素結石形成的線索，對反映腸粘膜屏障功能的腸粘膜形態(tài)學和腸粘膜免疫屏障功能等系列指標進行了檢測，以期了解膽色素結石形成過程與腸粘膜屏障功能異常相關性的證據(jù)。并進一步應用腸粘膜保護劑谷氨酰胺進行干預，觀察其對結石形成率以及腸道粘膜免疫屏障的影響

3、，旨在從一個新的角度——腸粘膜屏障功能，來探討膽色素結石的形成機制。 實驗方法: 一、實驗對象 豚鼠80只，雌雄各半，體質量200～250g，按照隨機原則分為三組：對照組(CON組)20只；致石組(PS組)30只；谷氨酰胺組(GLN組)30只；對照組給予普通豚鼠飼料，致石組給予致石飼料喂養(yǎng)，谷氨酰胺組給予添加谷氨酰胺的致石飼料，各飼養(yǎng)8周，觀察各指標。 二、標本采集 采集鼠末端回腸組織標本。

4、 三、檢測指標 (一) 致石率評定及紅外光譜結石定性：解剖顯露豚鼠膽囊，肉眼即可清晰辨別膽囊結石形成情況，采用紅外光譜溴化鉀壓片法，對結石成分進行定性，統(tǒng)計結石形成率。 (二) 腸粘膜細胞光鏡觀察：取距離回盲部5cm的回腸組織，石蠟包埋，HE染色光鏡下觀察，絨毛的高度，絨毛寬度，分別計數(shù)4個高倍鏡下(400×)腸粘膜固有層和上皮內的淋巴細胞數(shù)，取其均值。 (三) 免疫組化法標記計數(shù)腸粘膜淋巴細胞：取距離回盲部5

5、cm的回腸組織，免疫組化法處理，鏡檢棕黃色著色者為陽性細胞。分別記數(shù)4個高倍鏡下(400×)CD3+T細胞數(shù)和CD40+B細胞數(shù)，取其均值。 (四) 免疫組化法標記腸粘膜分泌IgA的漿細胞：取距離回盲部5cm的回腸組織，免疫組化法處理后，鏡檢棕黃色著色者為陽性細胞。分別記數(shù)4個高倍鏡下(400×)陽性漿細胞數(shù)。 實驗結果: 1、豚鼠膽囊膽色素結石模型構建情況：飼養(yǎng)8周，CON組豚鼠成石率為20％，致石組成石率為6

6、8.4％，使用谷氨酰胺作為腸粘膜保護劑的GLN組，成石率為36.8％，低于成石組。結石定性鑒定為膽色素結石。 2、腸粘膜細胞光鏡觀察：與CON組相比，PS組腸粘膜細胞絨毛排列紊亂，腸粘膜出現(xiàn)水腫和少量炎性細胞浸潤，血管擴張，腸壁各層變薄，絨毛高度降低，寬度減??；GLN組微絨毛排列略稀疏，水腫炎癥情況較輕。分別計數(shù)固有層和上皮內的淋巴細胞總數(shù)，結果表明PS組和GLN組的淋巴細胞數(shù)均要低于CON組；而GLN組的陽性淋巴細胞高于PS組

7、。 3、免疫組化法標記計數(shù)腸粘膜淋巴細胞：對各組腸粘膜的CD3+T細胞數(shù)和CD40+B細胞數(shù)進行記數(shù)，結果表明PS組和GLN組的陽性T和B淋巴細胞均要低于CON組；而GLN組的陽性淋巴細胞高于PS組。鼠回腸末端粘膜層CD3+CD40+陽性淋巴細胞，IgA+漿細胞(×400)4、免疫組化法標記腸粘膜分泌IgA的漿細胞：對各組IgA染色陽性的細胞數(shù)進行記數(shù)，結果表明PS組和GLN組的陽性漿細胞數(shù)均要低于CON組；而GLN組的陽性漿細

8、胞數(shù)高于PS組。 結論: 1、飲食誘導的豚鼠膽囊膽色素結石形成過程中，存在腸粘膜機械屏障和免疫屏障功能異常；膽色素結石的形成與腸粘膜機械屏障和免疫屏障功能異常具有一定相關性。 2、谷氨酰胺可改善成石模型中豚鼠的腸粘膜屏障功能，同時可降低膽色素結石的形成率。 3、腸屏障功能改變可能參與影響膽色素結石形成。細菌移位以及膽汁β-葡萄糖苷酸酶活性改變可能是腸粘膜屏障功能參與影響膽色素結石形成的機制之一。本實驗注意