黃芪甲苷、β-欖香烯抗肝癌作用及其免疫機(jī)制的研究.pdf

1、目的：1．通過(guò)體外研究觀察黃芪甲苷、β-欖香烯對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用，以及對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞(Mφ)、樹突狀細(xì)胞(DC)免疫功能的影響，同時(shí)觀察黃芪甲苷與β-欖香烯聯(lián)用后是否具有增效作用，探討黃芪甲苷、β-欖香烯對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖是否有抑制作用，同時(shí)是否能夠增強(qiáng)小鼠Mφ及DC的免疫功能。2．通過(guò)體內(nèi)研究觀察黃芪甲苷、β-欖香烯及其聯(lián)用對(duì)小鼠細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α變化的影響，探討黃芪甲苷、β-欖香烯是否能夠增強(qiáng)小鼠機(jī)體的

2、免疫功能，同時(shí)兩者聯(lián)用是否有增效作用。3．通過(guò)體內(nèi)研究觀察黃芪甲苷、β-欖香烯及其聯(lián)用對(duì)肝癌荷瘤小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用，并檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠的T淋巴細(xì)胞表型和脾細(xì)胞IFN-γ、IL-4的表達(dá)，探討黃芪甲苷、β-欖香烯對(duì)肝癌荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響及抗腫瘤作用。
　　 方法：體外研究：培養(yǎng)小鼠肝癌細(xì)胞株BNL-75，分別用不同濃度黃芪甲苷、β-欖香烯、塞來(lái)昔布處理后用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)，計(jì)算抑制率；培養(yǎng)小鼠Mφ株J

3、447A.1，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分空白組（陰性對(duì)照）、黃芪甲苷組、β-欖香烯組和聯(lián)合組（黃芪甲苷+β-欖香烯），收集經(jīng)藥物處理24h后的4組細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面MHCⅡ、MHCI、CD40、CD86的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β含量，Griess方法檢測(cè)細(xì)胞上清NO的表達(dá)；體外培養(yǎng)小鼠DC株D2SC，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分空白組、脂多糖(LPS)組、黃芪甲苷組、β-欖香烯組和聯(lián)合組（黃芪甲苷+β-欖香烯），

4、收集經(jīng)藥物處理24h后的5組細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面MHCⅡ、MHCI、CD40、CD80、CD86的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞表面IL-6、IL-12的表達(dá)。體內(nèi)研究：C57小鼠隨機(jī)分為黃芪甲苷組，β-欖香烯組，黃芪甲苷組+β-欖香烯組，空白對(duì)照組，每組6只，每日一次灌胃，空白對(duì)照組給予生理鹽水，每次500μl;黃芪甲苷組，β-欖香烯組，黃芪甲苷組+β-欖香烯組給予相應(yīng)藥液，每次各組給藥濃度100μg/ml，500μl，分別在給

5、藥第7、14、21天小鼠眼球后靜脈取血離心，分離血清，ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α的含量；建立肝癌皮下移植瘤模型，取建瘤成功的24只肝癌荷瘤小鼠，隨機(jī)分為黃芪甲苷組，β-欖香烯組，黃芪甲苷組+β-欖香烯組，空白對(duì)照組，每組6只，予建瘤成功次日連續(xù)每日一次灌胃，空白對(duì)照組給予生理鹽水，每次500μl;黃芪甲苷組，β-欖香烯組，黃芪甲苷組+β-欖香烯組給予相應(yīng)藥液，每次各組給藥濃度100μg/ml，500μl，

6、連續(xù)給藥15天，具體分組為：空白對(duì)照組（正常小鼠）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（荷瘤小鼠）、實(shí)驗(yàn)組（黃芪甲苷、β-欖香烯灌胃后的荷瘤小鼠），觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，停藥次日處死取脾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾細(xì)胞CD4、CD8的表達(dá)。
　　 結(jié)果：體外研究：黃芪甲苷、β-欖香烯對(duì)肝癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用，同時(shí)兩者聯(lián)用具有協(xié)同增效作用。與空白組相比，黃芪甲苷、β-欖香烯處理后Mφ表面MHCⅡ、MHCI、CD40、CD86分子的表達(dá)水平均顯著提高(p＜0.0

7、1，p＜0.05)，其中聯(lián)合處理后MHCⅡ、CD40、CD86表達(dá)明顯高于黃芪甲苷組(p＜0.05)，MHCI表達(dá)明顯高于β-欖香烯組(p＜0.05)。隨著黃芪甲苷、β-欖香烯濃度及作用時(shí)間的增加，Mφ吞噬中性紅的能力逐漸升高，100μg/ml的濃度作用24h后吞噬能力最佳，兩者聯(lián)用時(shí)有協(xié)同增效作用。不同濃度黃芪甲苷、β-欖香烯處理后Mφ上清TNF-α、IL-1β、NO的表達(dá)水平均高于空白組，100μg/ml濃度時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.

8、01，p＜0.05)，且各組表達(dá)水平均隨著加藥濃度的增加而提高；同一濃度聯(lián)合組表達(dá)TNF-α、IL-1β、NO均高于單用中藥組，黃芪甲苷組與β-欖香烯組無(wú)明顯差別；與單用黃芪甲苷或單用β-欖香烯相比，100μg/ml濃度的聯(lián)用組TNF-α、IL-1β、NO的表達(dá)明顯升高(p＜0.05）。與空白組、LPS組比較，黃芪甲苷、β-欖香烯及其聯(lián)合處理后的D2SC細(xì)胞表面MHCⅡ、MHCI、CD40、CD80、CD86分子的表達(dá)水平均顯著提高(p

9、＜0.01，p＜0.05)；與單用黃芪甲苷或單用β-欖香烯相比，黃芪甲苷與β一欖香烯聯(lián)合處理后MHCⅡ、MHCI、CD40、CD80、CD86分子表達(dá)水平明顯升高，部分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。黃芪甲苷、β-欖香烯處理后的D2SC細(xì)胞表面細(xì)胞因子IL-12、IL-6的表達(dá)水平均高于空白組與LPS組，其中黃芪甲苷組、β-欖香烯組處理后IL-12、IL-6表達(dá)明顯高于LPS組(p＜0.05)，聯(lián)合組處理后IL-12、IL-6表達(dá)顯著高于

10、LPS組（p＜0.01）；與單用黃芪甲苷組或單用β-欖香烯相比，黃芪甲苷、β-欖香烯聯(lián)合處理后IL-12、IL-6表達(dá)明顯升高（p＜0.05）。體內(nèi)研究：黃芪甲苷、β-欖香烯及聯(lián)合灌胃后小鼠體內(nèi)IL-2、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)水平明顯高于空白組(p＜0.01,p＜0.05)，且各組表達(dá)水平均隨著灌胃天數(shù)的增加而提高；與單用黃芪甲苷或單用β-欖香烯灌胄相比，聯(lián)合組小鼠灌胃后第21天體內(nèi)IL-2、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)明顯升高(

11、p＜0.05）。黃芪甲苷、β-欖香烯對(duì)肝癌荷瘤小鼠灌胃15天后，3組實(shí)驗(yàn)組小鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)趨勢(shì)較生理鹽水組明顯緩慢，聯(lián)合組在灌胃10天后腫瘤縮小趨勢(shì)更加明顯。與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組小鼠T細(xì)胞數(shù)量均有明顯下降；與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠T細(xì)胞數(shù)量明顯增多，與單個(gè)中藥組比較，聯(lián)合組小鼠T細(xì)胞數(shù)量增多。荷瘤小鼠經(jīng)中藥治療后，CD4+/CD8+比例增高，聯(lián)合用藥組顯著增高，CD4+/CD8+＞1(p＜0.05)。中藥治療后荷瘤小

12、鼠脾細(xì)胞IFN-γ、IL-4的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，其中黃芪甲苷組、β一欖香烯組IFN-γ、IL-4表達(dá)明顯高于對(duì)照組(p＜0.05），聯(lián)合組IFN-γ、IL-4表達(dá)顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)；與單用黃芪甲苷組或單用β-欖香烯治療相比，黃芪甲苷、β-欖香烯聯(lián)合治療荷瘤小鼠后IFN-γ、IL-4表達(dá)明顯升高(p＜0.05）。
　　 結(jié)論：1、黃芪甲苷、β-欖香烯對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，對(duì)肝癌荷瘤小鼠有明顯抑瘤作用，同時(shí)