欖香烯以食管癌細(xì)胞的抑制作用和機(jī)制.pdf

1、背景：
　　 食管癌是我國發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤之一。大量循證醫(yī)學(xué)資料說明，食管癌的治療除了手術(shù)、放療、化療、免疫治療等技術(shù)手段外，祖國中醫(yī)藥的治療占有重要的地位。目前，已有很多中草藥應(yīng)用于抗腫瘤臨床，產(chǎn)生了良好的療效，但一般抗癌機(jī)理尚不清楚。
　　 莪術(shù)是祖國中草藥之一，已作為方劑重要成分廣泛地應(yīng)用于腫瘤臨床，取得了一定的療效。本課題組前期與上海生命科學(xué)院藥物研究所合作，將莪術(shù)重要成分之一欖香烯處理不同分化程度的胃

2、癌細(xì)胞株和胃黏膜癌變大鼠模型，發(fā)現(xiàn)欖香烯可明顯抑制胃癌細(xì)胞的惡性增殖，其重要靶點是端粒酶。另外發(fā)現(xiàn)，c—myc、bcl—2和/或survivin基因表達(dá)下調(diào)，可能是欖香烯能有效地抑制胃癌細(xì)胞生長的重要機(jī)制之一。但到目前為止，對于欖香烯在食管癌細(xì)胞中的抗癌作用及內(nèi)在機(jī)制尚未明確。
　　 眾所周知，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多基因、多步驟的復(fù)雜過程，至少有103個以上基因參與這一過程?；蛐酒夹g(shù)在腫瘤研究中具有非常重要的應(yīng)用價

3、值。
　　 在基因功能研究領(lǐng)域中，RNA干擾(RNA interference，RNAi)和小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)引起了廣泛的關(guān)注?，F(xiàn)在很多研究已經(jīng)開始應(yīng)用RNAi和siRNA來探討與疾病相關(guān)的基因的功能。但目前尚無綜合基因芯片和RNAi技術(shù)探討欖香烯防治食管癌作用和機(jī)理的報道。
　　 本研究在前期工作基礎(chǔ)上，擬將基因芯片技術(shù)和RNAi技術(shù)結(jié)合起來，探討欖香烯治療食管癌的內(nèi)

4、在機(jī)理。本研究的順利進(jìn)行，不但可理解欖香烯防治食管癌的機(jī)理，也為深入探討中藥的抗癌機(jī)理探索一條可行的途徑，對中藥的現(xiàn)代化研究具有重要的意義，也會產(chǎn)生較大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
　　 目的：
　　 了解欖香烯對食管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用，從基因水平初步明確欖香烯治療食管癌的內(nèi)在機(jī)制。
　　 方法：
　　 采用不同劑量的欖香烯，處理3株食管癌細(xì)胞CaEs—17、Eca—109、TE—1后，于處理后不同時

5、間收集細(xì)胞，采用MTT方法觀察癌細(xì)胞生長增殖情況，采用劃痕試驗方法觀察癌細(xì)胞遷移情況，Transwell方法觀察癌細(xì)胞侵襲情況。初步了解欖香烯對癌細(xì)胞作用后，采用欖香烯處理Eca—109食管癌細(xì)胞后，采用基因芯片檢測相關(guān)基因表達(dá)情況，然后隨機(jī)選擇2個變化明顯的基因，采用熒光實時定量PCR方法驗證基因芯片結(jié)果；然后以siRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)干擾這兩個基因表達(dá)，采用Western Blot方法觀察相關(guān)基因干擾情況；分別采用劃痕試驗和Tr

6、answell方法觀察相關(guān)基因表達(dá)被干擾后癌細(xì)胞遷移和侵襲情況。
　　 結(jié)果：
　　 1．欖香烯對人食管癌細(xì)胞CaEs—17、Eca—109、TE—1體外增殖有一定的抑制作用，且具有劑量依賴性，72 h IC50分別為157．950μg/ml、189．036μg/ml、64．941μg/ml；
　　 2．不同濃度欖香烯對培養(yǎng)24 h后三株細(xì)胞遷移的影響：
　　 1)欖香烯抑制了人食管癌細(xì)胞CaEs—17遷

7、移能力，且具有劑量依賴性，80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、0μg/ml的間距分別為656±30、522±12、407±10、258±70；
　　 2)欖香烯抑制了人食管癌細(xì)胞Eca—109遷移能力，且具有劑量依賴性，80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、0μg/ml的間距分別為796±60、682±8、640±16、560±19；
　　 3)欖香烯抑制了人食管癌細(xì)胞TE—1遷移能力，且具有劑量依

8、賴性，80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、0μg/ml的間距分別為141±20、208±23、304±52、537±37。
　　 3．不同濃度的欖香烯對CaEs—17、Eca—109、TE—1食管癌細(xì)胞侵襲均有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性(r=0．789，P<0．01；r=0．862，P<0．01；r=0．833，P<0．01)。
　　 4．欖香烯對食管癌Eca—109細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　

9、1)欖香烯作用于Eca—109細(xì)胞24h后，共有166個基因表達(dá)發(fā)生明顯改變，其中表達(dá)上調(diào)的基因有65個，表達(dá)下調(diào)的基因有101個；
　　 2)隨機(jī)選擇表達(dá)變化明顯的Cripto—1和TROP—2基因，采用定量PCR檢測，結(jié)果顯示，Cripto—1和TROP—2基因下調(diào)，與基因芯片檢測結(jié)果比較無明顯差異(P>0．05)。
　　 5．Cripto—1和TROP—2基因siRNA轉(zhuǎn)染處理食管癌Eca—109后，癌細(xì)胞遷移和侵