檉柳乙烯響應因子ThERF1的克隆和功能分析.pdf

1、乙烯響應因子(ERF)是植物特有的一種轉(zhuǎn)錄因子,在植物對環(huán)境脅迫的應答方面起到重要的作用。ERF轉(zhuǎn)錄因子不僅能通過結(jié)合與病程相關(guān)基因啟動子中的GCC-box來調(diào)節(jié)它們的表達從而提高植物的抗病性,還能通過識別DRE和其他非GCC-box順式作用元件參與植物的非生物脅迫的應答。
　　 從檉柳cDNA文庫中得到一條乙烯響應因子(Ethylene response factor,ERF)基因的EST。序列,并命名為ThERF1。利用TA

2、IL-PCR的方法獲得ERF基因的完整序列,其開放讀碼框972 bp,共編碼323個氨基酸,分子量為34.1 KDa,理論等電點為8.95。氨基酸序列分析表明,該ERF轉(zhuǎn)錄因子含有一個典型的ERF結(jié)構(gòu)域,該區(qū)域中的第14和19位的氨基酸分別為丙氨酸和天冬氨酸,這是ERF類轉(zhuǎn)錄因子的一個典型特征。在C-末端含有一個EAR motif結(jié)構(gòu),所以該轉(zhuǎn)錄因子屬于ClassⅡ族的ERF轉(zhuǎn)錄因子,可能起到轉(zhuǎn)錄抑制的作用。利用TAIL-PCR技術(shù),克

3、隆得到ThERF1轉(zhuǎn)錄因子的啟動子序列1071bp。通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫對序列進行分析,發(fā)現(xiàn)該啟動子區(qū)域中除了包含多個啟動子結(jié)構(gòu)元件之外還包含多種信號傳遞和逆境響應相關(guān)的順式作用元件,如ABRE、TGACG-motif、MBS和CGTCA-motif。
　　 用以GAL4為基礎(chǔ)的酵母單雜交系統(tǒng)研究ThERF1轉(zhuǎn)錄因子可識別的順式作用元件。發(fā)現(xiàn)它既可以識別GCC-box又可以識別DRE順式作用元件。當把GCC-box順式作

4、用元件核心堿基中第4、5位的胞嘧啶和第2、5位的鳥嘌呤突變后,ThERF1轉(zhuǎn)錄因子就失去了對其的識別能力。
　　 為了研究與檉柳ThERF1轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白質(zhì),將ThERF1基因構(gòu)建到酵母雙雜交體系中的GAL4-BD載體中用作誘餌,從檉柳cDNA文庫中篩選其互作蛋白。結(jié)果顯示,ThERF1轉(zhuǎn)錄因子具有輕微的自激活活性,釣取到的5個能與其相互作用的蛋白質(zhì)中有3個已知蛋白分別為乙醛脫氫酶(NAD+)、蛋白質(zhì)延伸因子和ATP合成