腎上腺髓質(zhì)素對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：觀察腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin，ADM)對(duì)幼年大鼠心肌細(xì)胞(cardiacmyocyte)凋亡的影響，并探討其可能的作用受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 方法：1.細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定：用酶消化法分離細(xì)胞，差速貼壁法和藥物抑制成纖維樣細(xì)胞純化獲得心室肌細(xì)胞為材料，用光學(xué)顯微鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法鑒定細(xì)胞。2.檢測(cè)方法：MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活度，雙苯并咪唑(Hoechst33342)染料熒光顯微鏡檢測(cè)和DNA末端標(biāo)記法(

2、TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B(Akt)的表達(dá)。3.實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)不同的藥物及藥物不同濃度，實(shí)驗(yàn)共分五部分，第一部分：觀察ADM對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下的心肌細(xì)胞是否有影響。共分5組：不同濃度(10-10～10-7M)的ADM組和空白對(duì)照組。第二部分：觀察血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是否能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，并確定合適的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型的實(shí)驗(yàn)濃度。共分5組：不同濃度的(10-9～10-6M)AngⅡ組和空白對(duì)照組。第三

3、部分：觀察ADM對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響。共分6組：空白對(duì)照組，AngⅡ(10-7M)誘導(dǎo)凋亡對(duì)照組，不同濃度的ADM(10-10～10-7M)+AngⅡ(10-7M)組。第四部分：ADM在心肌細(xì)胞上作用的受體觀察ADM對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響：分別以CGRP受體拮抗劑(CGRP8-37)和ADM特異性受體拮抗劑(ADM22-52)進(jìn)行干預(yù)研究，共分6組：空白對(duì)照組，AngⅡ?qū)φ战M，AngⅡ+ADM對(duì)照組，AngⅡ+ADM+CGRP

4、8-37組，AngⅡ+ADM+ADM22-52組，AngⅡ+ADM+CGRP8-37+ADM22-52組。第五部分：ADM在心肌細(xì)胞受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究：①采用cAMP抑制劑(Br-cAMP)進(jìn)行干預(yù)研究，共分4組：空白對(duì)照組，AngⅡ?qū)φ战M，AngⅡ+ADM對(duì)照組，Br-cAMP+AngⅡ+ADM組；②對(duì)于Akt/PKB途徑研究分3組：設(shè)置空白對(duì)照組，AngⅡ?qū)φ战M，AngⅡ+ADM對(duì)照組，用特異性Akt單克隆抗體對(duì)此3組進(jìn)行免疫

5、細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)。4.數(shù)據(jù)處理：用SPSS12.0軟件包；細(xì)胞活度A值數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；細(xì)胞凋亡率數(shù)據(jù)處理，采用卡方檢驗(yàn)，兩兩比較采用標(biāo)準(zhǔn)四格表法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1.培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過(guò)光學(xué)顯微鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法鑒定為心肌細(xì)胞，純度達(dá)95％以上。 2.ADM在基礎(chǔ)狀態(tài)下對(duì)心肌細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響，AD

6、M各濃度組(10-10～10-7M)與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 3.ADM呈濃度依賴性地抑制AngⅡ的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡作用。ADM+AngⅡ各濃度組(10-10～10-7)A值明顯高于AngⅡ組(P＜0.05)，細(xì)胞凋亡率隨濃度的增加而降低，各濃度組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。10-7M濃度的ADM抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用最為顯著，與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

7、 4.ADM在心肌細(xì)胞上作用受體的研究：在AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的情況下，CGRP8-37和ADM22-52能顯著拮抗ADM對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用，與AngⅡ+ADM對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，二拮抗劑單獨(dú)作用均不能完全拮抗ADM作用，與AngⅡ組比較差異顯著(P＜0.05)，二者合用也不可完全拮抗ADM作用，與AngⅡ組比較差異顯著(P＜0.05)。 5.ADM在心肌細(xì)胞受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的

8、研究顯示：cAMP抑制劑Br-cAMP能阻斷ADM對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用，與AngⅡ+ADM對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.01)，與AngⅡ組比較仍有顯著差異(P＜0.01)。Akt免疫細(xì)胞化學(xué)，AngⅡ+ADM組可見少量細(xì)胞陽(yáng)性，說(shuō)明受體后的Akt/PKB途徑在一定意義上可能參與了ADM對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。 結(jié)論：1.ADM對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下的心肌細(xì)胞無(wú)影響； 2.ADM呈濃度依賴性地抑制AngⅡ介導(dǎo)的心