巴斯德桿菌科細(xì)菌復(fù)制溫敏型質(zhì)粒的構(gòu)建及初步應(yīng)用.pdf

1、巴斯德桿菌科(Pasteurellaceae)主要包括巴氏桿菌屬(Pasteurella),放線桿菌屬(Actinobacillus)和嗜血桿菌屬(Haemophilus)。此菌科包含大量使動(dòng)物致病的病原體,它們可以使很多家畜致病甚至死亡,給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,全世界對(duì)此菌科的病原菌的關(guān)注度日益增高。
　　 為了研究致病菌的致病機(jī)理,對(duì)其基因的功能進(jìn)行研究是必須的。基因功能研究的常規(guī)方法是構(gòu)建基因突變菌株。目前使用的基因

2、突變方法,如自然轉(zhuǎn)化,接合轉(zhuǎn)移以及自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率和發(fā)生同源重組雙交換的效率比較低下,所以一套高效的突變系統(tǒng)的建立是非常必要的。由于復(fù)制溫敏型質(zhì)粒在特定溫度下能夠自動(dòng)丟失,能夠快速鑒定發(fā)生同源重組雙交換的突變體,并且在PCR定向突變系統(tǒng)中能夠充當(dāng)表達(dá)載體和介導(dǎo)雙交換的克隆載體,在重組酶的輔助下,雙交換的概率會(huì)大大提高,因此復(fù)制溫敏型質(zhì)粒能夠很大程度上提高突變系統(tǒng)的效率。
　　 本研究對(duì)巴斯德桿菌科細(xì)菌來(lái)源的質(zhì)粒pD70K

3、anR進(jìn)行了序列測(cè)定和分析,發(fā)現(xiàn)此質(zhì)粒具有一個(gè)卡那霉素抗性基因,一個(gè)鏈霉素抗性基因和一個(gè)磺胺抗性基因,還含有一個(gè)在結(jié)合轉(zhuǎn)移中必不可少的mobA基因,并用DNAMAN軟件分析了此質(zhì)粒的酶切位點(diǎn),得到了一些單一酶切位點(diǎn),可用于克隆。隨后,驗(yàn)證了pD70KanR在APP和Pm中都是穿梭質(zhì)粒,通過(guò)PCR定點(diǎn)突變,構(gòu)建了在Pm和APP中的復(fù)制溫敏型質(zhì)粒pGA318和pSK-GA318,并分析了這兩個(gè)質(zhì)粒在Pm和APP中不同傳代時(shí)間和培養(yǎng)溫度下的復(fù)

4、制特性,即在30℃可以正常復(fù)制,經(jīng)過(guò)傳代,在高于41℃的情況下丟失。pGA318和pSK-GA318在Pm中,42℃?zhèn)?代即可丟失；pGA318和pSK-GA318在APP中,42℃要傳9代才能丟失。這些結(jié)果為構(gòu)建Pm和APP等巴斯德桿菌科細(xì)菌的高效突變系統(tǒng)打下了基礎(chǔ)。最后,將復(fù)制溫敏型載體pGA318應(yīng)用于APP脲酶C基因缺失的篩選,即將脲酶C基因的上下游同源臂克隆到pGA318中,然后利用同源重組的原理嘗試缺失APP的脲酶C基因,但