人源AGO2基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及初步應(yīng)用.pdf

1、miRNA是目前發(fā)現(xiàn)的具有重要生物學(xué)功能的內(nèi)源性非編碼RNA。現(xiàn)已知miRNA是通過RNA沉默復(fù)合體(RISC)降解或抑制靶基因的翻譯，但其中的具體作用機(jī)制還不很清楚。Argonaute(AGO)蛋白是RISC中最重要的組份。AGO蛋白具有不同的亞族，人類細(xì)胞中包含亞族AGO2蛋白的RISC具有剪切靶基因的活性。本論文的主要工作是構(gòu)建熒光蛋白AGO2的融合蛋白表達(dá)載體，獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白標(biāo)記AGO2的細(xì)胞體系，并由此研究miRNA發(fā)揮

2、功能的作用。
　　本論文取得了如下研究成果：
　　1、成功地構(gòu)建了重組熒光Kaede-AGO2表達(dá)載體。以HeLa細(xì)胞系為研究模型，通過提取HeLa細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄生成AGO2的cDNA；以cDNA為模板，通過PCR獲得含BamHⅠ及HindⅢ酶切位點(diǎn)的AGO2基因；采用TA克隆法及藍(lán)白斑篩選法獲得重組克隆載體pMD19T-AGO2；通過雙酶切技術(shù)及T4DNA聯(lián)接酶、抗藥篩選法獲得重組表達(dá)Kaede-AGO2載體。

3、>　　2、獲得了穩(wěn)定表達(dá)Kaede-AGO2的HeLa細(xì)胞系。通過陽離子轉(zhuǎn)染試劑將重組表達(dá)載體Kaede-AGO2導(dǎo)入HeLa細(xì)胞，優(yōu)化出轉(zhuǎn)染和篩選條件為：轉(zhuǎn)染濃度為DNA<3μg，DNA：轉(zhuǎn)染試劑=1:1；最佳篩選抗生素濃度為700μg/ml，維持生長(zhǎng)抗生素濃度為350μg/ml；維持細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)最佳配比：回收培養(yǎng)液：新鮮培養(yǎng)液1:1。
　　3、通過融合蛋白Kaede-AGO2研究了外源miRNA作用過程：觀察了AGO2在細(xì)胞內(nèi)