新型可復制型廣譜抗腫瘤雙質(zhì)粒DNA疫苗抑瘤活性的初步研究.pdf

1、研究背景:繼預防性疫苗之后,伴隨著免疫學、分子生物學和細胞生物學的不斷深入發(fā)展,近年來治療性疫苗發(fā)展迅速。通過重新喚起機體對靶抗原的免疫應答能力,治療性疫苗可以在患病個體誘導特異性免疫應答,清除病原體或異常細胞,使疾病得以治愈。治療性疫苗已經(jīng)成為防治惡性腫瘤術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移的重要技術(shù)手段。由于DNA疫苗具有抗原性特異、應用安全及生產(chǎn)便捷的顯著優(yōu)點,作為一種特殊的高技術(shù)生物治療藥物,多種類型的DNA疫苗已經(jīng)進入了臨床前期及臨床試驗。針對惡性腫

2、瘤治療中的核心難題―免疫耐受‖,基于自主研發(fā)的可復制型DNA疫苗載體系統(tǒng),本課題組開展了治療性疫苗的免疫增效策略研究,并成功構(gòu)建了新型雙質(zhì)粒可復制型抗腫瘤DNA疫苗。我們選擇在多種實體腫瘤中廣泛表達的兩種腫瘤抗原HCG和Survivin,并選擇與腫瘤血管新生關(guān)系密切的靶點VEGFR2,利用異種化抗原設計技術(shù),構(gòu)建了抗腫瘤多靶點異種同源基因復合抗原,可以有效打破腫瘤對自身抗原的免疫耐受,激活高效的細胞免疫和體液免疫反應,從而提高腫瘤臨床治

3、愈率。
　　研究目的:在實驗室前期堅實的工作基礎(chǔ)之上,構(gòu)建由CAVA及CAVE組成的可復制型雙質(zhì)粒DNA疫苗,通過肌肉注射聯(lián)合電脈沖的方法將得到的雙質(zhì)粒疫苗遞送到小鼠體內(nèi),觀察疫苗的抑瘤效果并對其可能的免疫學機制進行初步的探討。
　　方法:
　　1.利用胰蛋白酶灌注消化法分離收集人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells,HUVEC),進一步采用腫瘤細胞HepG2培養(yǎng)上清液誘

4、導HUVEC向腫瘤源性內(nèi)皮細胞(Tumorderived-EndothelialCells,Td-EC)分化增殖。通過形態(tài)學觀察和熒光標記Ⅷ因子相關(guān)抗原,鑒定血管內(nèi)皮細胞;利用RT-PCR檢測Td-EC中腫瘤血管內(nèi)皮標志物(TEM)的表達。
　　2.將小鼠VEGFR2胞外1-4IgG樣區(qū)域(mVEGFR2D1-4)及人β-hcg全長基因分別克隆到原核表達載體pET-42a中,將得到的原核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)

5、感受態(tài)中并通過IPTG誘導表達,親和層析法純化融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析,Westernblot鑒定純化后的目的蛋白,ELISA法檢測純化蛋白的抗原活性。
　　3.利用前期成功構(gòu)建的質(zhì)粒pVAX1-mVEGFR2-GFc-hIL12及可復制型載體系統(tǒng)PSVK,構(gòu)建以異種化的mVEGFR2D1-4為靶抗原的可復制型DNA疫苗,命名為CAVE。
　　4.將DNA疫苗CAVE與前期構(gòu)建好的CAVA采用電穿孔肌肉內(nèi)注射的方式免

6、疫小鼠,觀察DNA疫苗的抑瘤效果,并對其相關(guān)的免疫學機制進行初步的研究:采用ELISA檢測免疫小鼠血清中的特異抗體滴度和血清中的細胞因子的水平;采用ELISPOT法檢測免疫小鼠脾淋巴細胞特異性IFN-γ的分泌;采用海藻酸鹽包裹腫瘤細胞移植物評價抗血管生成情況;對腫瘤組織進行CD31免疫組化染色觀察疫苗免疫后腫瘤毛細血管密度。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離得到了HUVEC,并將其誘導成為具有良好生物學活性的具有腫瘤源內(nèi)皮細胞特

7、性的Td-EC。
　　2.成功誘導并純化出具有良好免疫原性的mVEGFR2D1-4/GST及人β-hcg/GST融合蛋白。
　　3.成功構(gòu)建了可復制型DNA疫苗CAVE,并通過WesternBlot檢測證實了其體外真核表達。
　　4.觀察聯(lián)合應用與單獨應用兩種DNA疫苗免疫后的C57BL/6小鼠移植瘤生長趨勢,發(fā)現(xiàn)與對照組相比疫苗免疫組小鼠腫瘤生長受到顯著抑制,聯(lián)合應用免疫組效果更為顯著。疫苗免疫組小鼠血清內(nèi)可檢測到特