重組人IL-38的制備及其抑制小鼠肺纖維化的作用.pdf

1、目的：克隆人白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-38基因，構(gòu)建其真核、原核表達(dá)載體，完成 IL-38重組蛋白的表達(dá)、純化及活性分析；構(gòu)建 IL-38慢病毒表達(dá)載體，并進(jìn)行其慢病毒包裝與鑒定，研究 IL-38對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的作用及機(jī)制。
　　方法：從人皮膚組織中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增IL-38基因的全長(zhǎng)編碼序列，將其克隆入真核表達(dá)載體 pcDNA3.1/V5-His-TOPO，構(gòu)建其 pcDNA

2、-3.1-hIL-38-V5-His重組質(zhì)粒；以pcDNA-3.1-hIL-38-V5-His為模板擴(kuò)增IL-38成熟蛋白編碼區(qū)，構(gòu)建IL-38 pET-44-hIL-38原核表達(dá)載體，將測(cè)序正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入 BL21(DE3)大腸桿菌表達(dá)菌株中獲得 IL-38表達(dá)工程菌株，用適當(dāng)濃度的IPTG誘導(dǎo)工程菌株表達(dá)IL-38重組蛋白，并利用其C末端的組氨酸標(biāo)簽(His-tag)進(jìn)行鎳離子親和層析純化目的蛋白，將純化的重組IL-38作用于

3、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞，研究純化IL-38蛋白的生物學(xué)活性；構(gòu)建IL-38慢病毒表達(dá)載體 pLVX-hIL-38-IRES-Green1，將該重組表達(dá)載體與其余三個(gè)包裝載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞株，包裝并收集慢病毒，建立博來(lái)霉素(bleomycin，BLM)滴鼻給藥C57BL/6雄性小鼠誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型，將 IL-38病毒上清滴鼻小鼠，研究 IL-38對(duì)小鼠肺纖維化發(fā)病的影響。

4、>　　結(jié)果：構(gòu)建的IL-38真核、原核及慢病毒表達(dá)載體的測(cè)序結(jié)果均與 GenBank中的基因序列一致；IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-38蛋白主要以可溶性形式存在，純化的目的蛋白經(jīng) SDS-PAGE凝膠電泳分析和Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)，蛋白純度可達(dá)98％，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明純化的目的蛋白具有較高的生物學(xué)活性；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-38可減少肺部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、細(xì)胞外基質(zhì)及膠原的沉積，可改善肺肺泡壁結(jié)構(gòu)，可抑制腫瘤壞死因子(tumor ne

5、crosis factor，TNF)-α、IL-4、IL-6、IL-17、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP)-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)-2、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等前炎癥因子和促纖維化因子的產(chǎn)生，也可促進(jìn)