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文檔簡介
1、第一部分α-Ac-Tub在人體(煤)矽肺標本中的表達及其病理學意義
目的:觀察與分析α-Ac-Tub在人體(煤)矽肺標本中表達及其臨床病理學的意義。
方法:
1(煤)矽肺患者樣本來自于59例尸檢病例,年齡最小30歲,最大77歲,平均年齡52歲。分別來自內(nèi)蒙、山西、湖南、河北等省煤礦以及水泥、陶瓷、耐火材料廠的工人(煤礦井下作業(yè)工人45例、其他作業(yè)工人14例)。其中Ⅰ期(煤)矽肺22例、Ⅱ期(煤)矽肺8例、Ⅲ
2、期(煤)矽肺7例,(煤)矽塵性反應(yīng)22例。最短接塵史7年,最長為46年,平均22年。13例對照組選取外科手術(shù)切除肺組織標本(均為年齡相近無接塵史的臨床患者)。
2 HE染色、Masson染色觀察病理形態(tài)變化。免疫組織化學染色法用以檢測肺組織中α-SMA、vimentin和α-Ac-Tub的表達情況。免疫熒光法檢測α-Ac-Tub和vimentin以及α-Ac-Tub和SP-A的共定位表達情況。
結(jié)果:
1在
3、人體(煤)矽肺標本中,能夠較好的觀察到矽肺病變發(fā)生演變的過程。既吞噬粉塵的巨噬細胞性肺泡炎---細胞性結(jié)節(jié)---細胞纖維性結(jié)節(jié)---纖維性結(jié)節(jié)(包括玻璃樣變性的結(jié)節(jié))。
2α-SMA陽性標記的肌成纖維細胞定位分布于結(jié)節(jié)性病灶和彌漫性間質(zhì)纖維化區(qū)域。
3α-Ac-Tub可表達于正常肺組織的多種細胞(包括支氣管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞和肺成纖維細胞等)。在人體(煤)矽肺標本中于病變區(qū)(結(jié)節(jié)性病灶和彌漫性間質(zhì)纖
4、維化區(qū)域)缺失表達。
4免疫熒光結(jié)果顯示在人體矽肺標本中有α-Ac-Tub和 vimentin、α-Ac-Tub和SP-A陽性共定位表達的細胞,其中vimentin在病變纖維化區(qū)域的表達明顯增強,而α-Ac-Tub和 SP-A在病變的結(jié)節(jié)病灶和間質(zhì)纖維化區(qū)域缺失表達。
第二部分 Ac-SDKP靶向調(diào)節(jié)α-Ac-Tub的表達對抑制大鼠矽肺纖維化的調(diào)控作用
目的:采用支氣管灌注SiO2構(gòu)建矽肺大鼠模型,并予以A
5、c-SDKP抗纖維化治療和預(yù)防治療。通過對α-Ac-Tub、HDAC6和α-SMA在矽肺大鼠肺組織中的定位、分布與表達的觀察與分析,研究與探討α-Ac-Tub在矽肺發(fā)生過程中的作用,以及Ac-SDKP對α-Ac-Tub調(diào)節(jié)在抑制矽肺纖維化形成時的作用與機制。
方法:
1采用非暴露式一次性灌注SiO2構(gòu)建矽肺大鼠模型。實驗分組為:1)對照4 w組:在腹腔內(nèi)埋入注有2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊,支氣管內(nèi)灌注1 ml生理
6、鹽水,飼養(yǎng)4 w后處理動物;2)對照8 w組:腹腔內(nèi)埋入注有2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊,支氣管內(nèi)灌注1 ml生理鹽水,飼養(yǎng)8 w后處理動物;3)矽肺模型4 w組:在腹腔內(nèi)埋入注有2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊,支氣管內(nèi)灌注含有50 mg SiO2的1 ml生理鹽水,飼養(yǎng)4 w后處理動物;4)矽肺模型8 w組:在腹腔內(nèi)埋入注有2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊,支氣管內(nèi)灌注含有50 mg SiO2的1 ml生理鹽水,飼養(yǎng)8 w后處理動物;
7、5)Ac-SDKP抗纖維化治療組:支氣管內(nèi)灌注含有50 mg SiO2的1 ml生理鹽水,在腹腔內(nèi)埋入注有2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊,4 w后更換為含有800μg/kg/d Ac-SDKP的2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊,持續(xù)至8 w后處理;6)Ac-SDKP預(yù)防治療組:灌塵前48 h腹腔內(nèi)埋入含有800μg/kg/d Ac-SDKP的2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊,支氣管內(nèi)灌注含有50 mg SiO2的1 ml生理鹽水,持續(xù)至8
8、w后處理。
2 HE染色觀察肺組織病理形態(tài);免疫組織化學染色檢測α-Ac-Tub、α-SMA、HDAC6在肺組織中的定位、分布與表達。免疫熒光法檢測α-Ac-Tub和α-Tub、α-Ac-Tub和 SP-A、α-Ac-Tub和 vimentin、HDAC6和α-Ac-Tub、HDAC6和α-SMA的共表達。免疫印跡法(Western blot)檢測α-SMA、α-Ac-Tub、HDAC6和I型膠原的表達水平。
結(jié)果:
9、
1HE染色結(jié)果顯示,對照4w組和8w組大鼠雙側(cè)肺組織結(jié)構(gòu)清晰,未見明顯異常。矽肺模型4w組可見肺泡壁增寬,多伴有巨噬細胞和炎細胞的浸潤,可見細胞性矽結(jié)節(jié)的形成;矽肺模型8w組多見矽結(jié)節(jié)的融合,伴有間質(zhì)肺纖維化的形成。無論是Ac-SDKP抗纖維化治療組還是預(yù)防治療組,其矽結(jié)節(jié)的面積較矽肺模型8w組顯著減小,肺組織內(nèi)纖維化程度明顯降低。
2免疫組織化學染色結(jié)果顯示,α-Ac-Tub除可強表達于支氣管上皮細胞外,還可在肺
10、泡壁上的肺泡Ⅱ型上皮細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞中陽性表達,使用不同公司商品化抗體均獲得一致的結(jié)果。免疫熒光結(jié)果顯示α-Ac-Tub存在和SP-A以及vimentin陽性共表達細胞。
3免疫組織化學染色結(jié)果顯示,在對照組中,α-SMA僅陽性表達于氣管、血管的平滑肌細胞,而在矽肺模型組中,α-SMA可強表達于矽結(jié)節(jié)和間質(zhì)纖維化區(qū)。而α-Ac-Tub除可陽性表達于支氣管纖毛上皮細胞,而在肺泡壁上多種細胞中陽性表達;在矽肺模型組中,α
11、-Ac-Tub在矽結(jié)節(jié)和間質(zhì)纖維化區(qū)域中缺失表達,尚在矽結(jié)節(jié)周圍較為正常肺泡壁中仍存在明顯的陽性表達。免疫印跡(western blot)結(jié)果顯示,與對照組相比,矽肺模型組的I型膠原、α-SMA表達水平上調(diào),而α-Ac-Tub的表達下調(diào);給予 Ac-SDKP抗纖維化治療組或預(yù)防治療后,能夠顯著上調(diào)α-Ac-Tub的表達,同時下調(diào)I型膠原和α-SMA蛋白水平。
4免疫組織化學染色結(jié)果顯示,HDAC6在正常對照組中可陽性表達于支氣
12、管上皮細胞(胞漿表達)和部分肺泡Ⅱ型上皮細胞(核表達)中,而在模型組中多表達于巨噬細胞和間質(zhì)纖維化區(qū)域(胞漿表達)。免疫熒光檢測結(jié)果顯示,HDAC6與α-SMA多高表達于矽結(jié)節(jié)區(qū)域,而α-Ac-Tub陽性表達多位于矽結(jié)節(jié)邊緣以及較為正常的肺泡壁上。免疫印跡(western blot)結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組 HDAC6的表達顯著上調(diào),而給予Ac-SDKP抗纖維化治療和預(yù)防治療均能夠顯著抑制HDAC6的表達。
第三部分 A
13、c-SDKP對α-Ac-Tub的調(diào)節(jié)抑制AngⅡ介導的肌成纖維細胞分化的作用及其機制
目的:原代培養(yǎng)的大鼠肺成纖維細胞,并予以AngⅡ誘導分化為肌成纖維細胞。給予Ac-SDKP、AT1抑制劑valsartan、HDAC6特異性抑制劑TCS HDAC620b和ROCK信號抑制劑Y-27632預(yù)處理,觀察Ac-SDKP是否可通過對AT1、ROCK信號通路的調(diào)節(jié)而抑制HDAC6的表達,進而穩(wěn)定α-Ac-Tub,發(fā)揮其抑制肌成纖維細胞
14、分化的作用。
方法:將原代培養(yǎng)大鼠肺成纖維細胞分組為:1)對照組;2)AngⅡ誘導組;3)AngⅡ+Ac-SDKP組;4)AngⅡ+valsartan組;5)AngⅡ+TCS HDAC620b組;6)AngⅡ+Y-27632組。
結(jié)果:
1免疫熒光結(jié)果顯示,AngⅡ誘導后,α-Tub熒光強度并無明顯變化,而α-Ac-Tub熒光強度顯著降低。
2免疫熒光結(jié)果顯示,與對照組相比,AngⅡ能夠顯著誘導肺
15、成纖維細胞向肌成纖維細胞分化,胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量交叉和平行排列的肌絲樣α-SMA蛋白在胞漿內(nèi)呈現(xiàn)少量綠色的微弱熒光表達,α-Ac-Tub蛋白在胞漿以細胞核為中心呈現(xiàn)出放射狀細絲樣紅色熒光表達;AngⅡ顯著促進α-SMA的表達,胞漿內(nèi)α-SMA呈現(xiàn)為或交叉或平行的肌絲樣結(jié)構(gòu),而標記α-Ac-Tub的熒光明顯減弱。予以Ac-SDKP、valsartan、TCS HDAC620b以及Y-27632預(yù)處理,較于AngⅡ誘導組比較,能夠顯著減弱α-S
16、MA的熒光強度,而增加α-Ac-Tub熒光表達。免疫印跡(western blot)結(jié)果顯示:與對照組相比,AngⅡ組的Ⅰ型膠原和α-SMA表達水平顯著上調(diào),而α-Ac-Tub的表達下調(diào);予以Ac-SDKP、valsartan、TCS HDAC620b以及Y-27632預(yù)處理能夠顯著抑制AngⅡ誘導的相應(yīng)蛋白變化。
3免疫印跡法結(jié)果顯示,與對照組相比,AngⅡ能夠顯著上調(diào)HDAC6的蛋白表達水平,而予以 Ac-SDKP、val
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