基于群體感應(yīng)分析腐敗希瓦氏菌對副溶血弧菌毒力因子的影響機(jī)制.pdf

1、副溶血弧菌是引起海產(chǎn)品源食物中毒的最主要致病菌，其常與水產(chǎn)品中的優(yōu)勢腐敗菌——腐敗希瓦氏菌共存于近岸海水和海產(chǎn)品中。在與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)體系中，副溶血弧菌的溶血活性、耐熱直接溶血毒素基因（tdh）、生物被膜等毒力因子表達(dá)量顯著增加，致病力也顯著增強(qiáng)，但其相互作用機(jī)制尚不清楚。由于群體感應(yīng)在細(xì)菌毒力因子表達(dá)與細(xì)菌菌群相互作用中有重要調(diào)控作用，本研究從群體感應(yīng)角度研究腐敗希瓦氏菌對副溶血弧菌毒力因子的影響機(jī)制。
　　1.以副溶血弧菌

2、ATCC33847為親本株，利用同源重組技術(shù)分別構(gòu)建副溶血弧菌群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因luxM、luxS敲除突變株VPΔLuxM、VPΔLuxS，通過氯霉素抗性、菌落PCR和DNA測序?qū)蚯贸蛔冎赀M(jìn)行驗(yàn)證;比較VPΔLuxM、VPΔLuxS與親本株的生長表型、溶血活性、tdh基因表達(dá)、生物被膜形成能力等生物學(xué)特性差異。結(jié)果顯示，副溶血弧菌群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因luxM、luxS敲除突變株VPΔLuxM、VPΔLuxS構(gòu)建成功;

3、VPΔLuxM的生長較親本株弱，其溶血活性、tdh基因表達(dá)量、生物被膜形成量較親本株顯著增加(p＜0.05)，VPΔLuxS的溶血活性、tdh基因表達(dá)量較親本株顯著降低(p＜0.05)，生物被膜形成量較親本株顯著增加(p＜0.05)。
　　研究表明，副溶血弧菌的群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因luxM對其溶血活性、tdh基因表達(dá)、生物被膜形成有調(diào)控抑制作用，對其生長有正向調(diào)控作用;副溶血弧菌的群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因luxS對其溶血活

4、性、tdh基因表達(dá)有正向調(diào)控作用，對生物被膜形成有調(diào)控抑制作用。
　　2.分別建立腐敗希瓦氏菌菌體、腐敗希瓦氏菌上清提取物與副溶血弧菌親本株、突變株VPΔLuxM、VPΔLuxS的共培養(yǎng)體系，對比腐敗希瓦氏菌對副溶血弧菌親本株、突變株的溶血活性、tdh基因表達(dá)、生物被膜等毒力因子作用效應(yīng)，從群體感應(yīng)角度研究腐敗希瓦氏菌對副溶血弧菌毒力因子的影響機(jī)制。
　　相對溶血活性結(jié)果顯示，腐敗希瓦氏菌上清提取物對ATCC33847、VP

5、ΔLuxM、VPΔLuxS的溶血活性均有顯著增強(qiáng)作用(p＜0.05)，分別增加了1.51倍、1.24倍、2.46倍。VPΔLuxS在腐敗希瓦氏菌菌體、腐敗希瓦氏菌上清提取物共培養(yǎng)體系中的溶血活性規(guī)律與ATCC33847相同。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各體系下ATCC33847、VPΔLuxM、VPΔLuxS的tdh基因表達(dá)量可知，腐敗希瓦氏菌菌體對ATCC33847、VPΔLuxM、VPΔLuxS的tdh表達(dá)均有顯著增強(qiáng)作用(p＜0.05

6、)，分別增加了2.46、7.66、1.51倍，腐敗希瓦氏菌上清提取物對ATCC33847、VPΔ LuxM、VPΔLuxS的tdh表達(dá)量分別增加了1.60、17.68、1.14倍。VPΔLuxM在腐敗希瓦氏菌菌體、腐敗希瓦氏菌上清提取物共培養(yǎng)體系中的溶血活性規(guī)律與ATCC33847相同。
　　結(jié)晶紫法檢測各體系中的生物被膜可知，腐敗希瓦氏菌上清提取物對ATCC33847、VPΔLuxM、VPΔLuxS生物被膜形成能力均有顯著減弱作

7、用(p＜0.05)，分別降至原來的0.84、0.53、0.75;腐敗希瓦氏菌上清提取物、腐敗希瓦氏菌菌體的加入對VPΔLuxM生物被膜的影響效應(yīng)與ATCC33847相同;熒光原位雜交及顯微鏡觀察生物被膜結(jié)構(gòu)可知，VPΔLuxM、VPΔLuxS的生物被膜較ATCC33847致密、團(tuán)聚成蘑菇狀，腐敗希瓦氏菌上清提取物的加入使ATCC33847、VPΔLuxM、VPΔLuxS被膜結(jié)構(gòu)更厚實(shí)、聚成團(tuán)狀，腐敗希瓦氏菌菌體的加入使ATCC33847

8、、VPΔLuxS、VPΔLuxM的生物被膜結(jié)構(gòu)變得松散。
　　結(jié)果表明，腐敗希瓦氏菌可能通過其產(chǎn)生的AHLs信號(hào)分子競爭性結(jié)合至副溶血弧菌LuxM群體感應(yīng)系統(tǒng)或者通過某種代謝產(chǎn)物降解副溶血弧菌AHLs信號(hào)分子影響副溶血弧菌的溶血活性、tdh基因表達(dá)、生物被膜形成;或者腐敗希瓦氏菌通過其產(chǎn)生的AI-2信號(hào)分子結(jié)合至副溶血弧菌LuxS群體感應(yīng)系統(tǒng)影響其溶血活性、tdh基因表達(dá)、生物被膜形成。
　　3.對腐敗希瓦氏菌與ATCC33

9、847、VPΔLuxM、VPΔLuxS共培養(yǎng)體系中的AHLs信號(hào)分子、AI-2信號(hào)分子、溶血活性、生物被膜進(jìn)行動(dòng)態(tài)測定，研究腐敗希瓦氏菌-信號(hào)分子-副溶血弧菌毒力因子的級聯(lián)作用，建立LC-MS/MS法檢測AHLs信號(hào)分子，對ATCC33847與腐敗希瓦氏菌的AHLs信號(hào)分子譜（種類、含量）進(jìn)行對比研究。
　　溶血活性體系研究結(jié)果顯示，AHLs信號(hào)分子隨細(xì)菌生長代謝逐漸累積，AI-2信號(hào)分子量在細(xì)菌生長期至穩(wěn)定期隨菌體量增加逐漸增加

10、，30h以后降解、總量減少;腐敗希瓦氏菌與VPΔLuxS共培養(yǎng)體系的溶血活性隨其AI-2信號(hào)分子量變化，與其AHLs信號(hào)分子量無明顯相關(guān)性。生物被膜體系研究結(jié)果顯示，AI-2信號(hào)分子量隨生物被膜被膜增加/衰弱呈現(xiàn)相應(yīng)的增、減，腐敗希瓦氏菌與VPΔLuxS共培養(yǎng)體系的生物被膜隨其AI-2信號(hào)分子量變化，與其AHLs信號(hào)分子量無明顯相關(guān)性。腐敗希瓦氏菌產(chǎn)生C6-HSL(23.47μg/L)、C12-HSL(3.49μg/L)、3-oxo-C

11、12-HSL(0.37μg/L)信號(hào)分子;ATCC33847產(chǎn)生C4-HSL(11.79μg/L)、3-oxo-C6-HSL（0.46μg/L）、3-oxo-C14-HSL(0.62μg/L)信號(hào)分子。
　　結(jié)果表明，腐敗希瓦氏菌通過其產(chǎn)生的某種代謝產(chǎn)物降解副溶血弧菌AHLs信號(hào)分子影響副溶血弧菌的溶血活性、tdh表達(dá)、生物被膜形成，或者通過其產(chǎn)生的AI-2信號(hào)分子結(jié)合至副溶血弧菌LuxS群體感應(yīng)系統(tǒng)影響其溶血活性、tdh基因表達(dá)

12、、生物被膜形成。
　　綜上，本研究從群體感應(yīng)角度研究了腐敗希瓦氏菌對副溶血弧菌毒力因子的影響機(jī)制，證實(shí)了群體感應(yīng)在副溶血弧菌溶血活性、tdh基因表達(dá)及生物被膜等毒力因子表達(dá)中具有重要調(diào)控作用，為副溶血弧菌毒力因子與致病力控制提供理論支持與指導(dǎo);證實(shí)了腐敗希瓦氏菌通過其產(chǎn)生的某種代謝產(chǎn)物降解副溶血弧菌AHLs信號(hào)分子影響其毒力因子表達(dá)，或者通過其產(chǎn)生的AI-2信號(hào)分子結(jié)合至副溶血弧菌LuxS群體感應(yīng)系統(tǒng)影響其毒力因子表達(dá)，可作為菌群