大黃魚(yú)源Shewanella baltica群體感應(yīng)LuxS蛋白及cyclo-(L-Pro-L-Leu)信號(hào)分子功能研究.pdf

1、近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)食品腐敗菌中群體感應(yīng)(Quroum sensing，QS)現(xiàn)象產(chǎn)生興趣。波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）為革蘭氏陰性嗜冷菌，是多種海產(chǎn)品的特定腐敗菌(Specific spoilageorganisms，SSO)。前期研究表明，大黃魚(yú)源S.baltica中存在AI-2和二酮哌嗪類(lèi)(Diketopiperazine，DKPs)信號(hào)分子，其中cyclo-(L-Pro-L-Leu)外源刺激能夠促進(jìn)S.

2、baltica的腐敗能力。然而，S.baltica QS系統(tǒng)的分子信息及感應(yīng)受體蛋白與其調(diào)控腐敗基因的機(jī)制的研究較少。鑒于此，本研究以冷藏大黃魚(yú)中分離鑒定的特定腐敗菌S.baltica SB11為研究對(duì)象，從生物信息學(xué)角度分析S.baltica LuxR家族蛋白和AI-2合成酶LuxS蛋白;構(gòu)建和驗(yàn)證luxS基因缺失株，比較研究其對(duì)生長(zhǎng)、生物被膜及致腐表型的影響;基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)對(duì)S.bal

3、tica的基因表達(dá)及代謝通路的影響，旨在更加全面地了解S.baltica的QS系統(tǒng)，為新型保鮮劑的研發(fā)提供理論支持。主要結(jié)果如下:
　　利用生物報(bào)菌法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)、氣相色譜(GC)檢測(cè)了S.baltica SB11培養(yǎng)上清中信號(hào)分子，發(fā)現(xiàn)S.baltica SB11上清液中含有AI-2和cyclo-(L-Pro-L-Leu)、cyclo-(L-Pro-L-Phe)信號(hào)分子，而無(wú)AHLs活性。生物信

4、息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)S.baltica BA175基因組中無(wú)luxI同源基因，而共發(fā)現(xiàn)11個(gè)luxR家族同源基因，其中8個(gè)LuxR家族蛋白與雙組份系統(tǒng)相關(guān)，接著與8個(gè)已知的QS受體LuxR蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)和保守氨基酸分析，發(fā)現(xiàn)NCBI中蛋白序列號(hào)為AEG10146.1與AEG11800.1可能為L(zhǎng)uxR solo蛋白，并在S.baltica SB11基因組中擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的luxR基因。同時(shí)，在S.baltica SB11中擴(kuò)增出luxS基因，由51

5、0個(gè)堿基即169個(gè)氨基酸構(gòu)成，BLASTP結(jié)果表明其與S.baltica、腐敗希瓦氏菌（Shewanellaputrefaciens）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)等LuxS蛋白氨基酸序列相似度較高，相似度均超過(guò)80％，與S.baltica BA175的LuxS蛋白氨基酸序列相似度更是達(dá)到100％。進(jìn)化樹(shù)及蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，S.baltica SB11

6、 LuxS蛋白較為保守，擁有組氨酸(His-54)、組氨酸(His-58)和谷氨酸(Glu-57)與半胱氨酸(Cys-127)組成的二價(jià)鋅離子的結(jié)合位點(diǎn)，以及對(duì)LuxS活性起重要作用的絲氨酸(Ser-6)，組氨酸(His-11)和精氨酸(Arg-39)，谷氨酸(Glu-93)等保守氨基酸，三維結(jié)構(gòu)模擬顯示該LuxS蛋白由4個(gè)α螺旋和5個(gè)β折疊片構(gòu)成，兩個(gè)亞基表面均有一個(gè)鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，與多種菌的LuxS蛋白空間結(jié)構(gòu)相似。
　　構(gòu)建

7、S.baltica SB11 luxS基因缺失株，采用PCR擴(kuò)增與AI-2活性驗(yàn)證缺失株luxS基因已成功缺失，并比較分析在4℃以及28℃條件下野生株與缺失株的生長(zhǎng)、生物被膜及胞外多糖形成和粘附能力、泳動(dòng)能力、蛋白酶活性、腐敗代謝物、蛋白表達(dá)的差異。研究發(fā)現(xiàn)，在4℃和28℃下S.baltica野生株SB11和luxS基因缺失株ΔSB11的生長(zhǎng)無(wú)顯著差異。相對(duì)于野生株，缺失株ΔSB11生物被膜的形成顯著減少，4℃下培養(yǎng)96 h后，其生物被

8、膜總量只有野生株的80％，而在28℃下培養(yǎng)24 h后，其總量?jī)H為野生株的72％。相似地，缺失株ΔSB11胞外多糖含量也顯著低于野生株SB11(P＜0.05)，4℃條件下培養(yǎng)120h僅為0.051 mg/mL，而野生株為0.060 mg/mL，28℃條件培養(yǎng)24 h為0.056 mg/mL，而野生株為0.064 mg/mL。同時(shí)，S.baltica luxS基因缺失株在不銹鋼片上的粘附能力也明顯減弱，在4℃下培養(yǎng)72 h，野生株與缺失株粘

9、附量分別為7.25和6.78 Log10 CFU/cm2，在28℃培養(yǎng)24 h后粘附量分別達(dá)到6.85與6.40 Log10 CFU/cm2。熒光顯微鏡觀察顯示，野生株SB11能快速粘附于蓋玻片表面，聚集并形成大量生物被膜，而缺失株ΔSB11更傾向于形成平坦稀疏的生物被膜，而且細(xì)菌并不聚集成團(tuán)。同時(shí)野生株和缺失株的泳動(dòng)性存在差異(P＜0.05)，4℃培養(yǎng)72 h后，突變株和的野生株擴(kuò)散直徑分別32.3和25.9 mm，28℃下培養(yǎng)48

10、h后其擴(kuò)散直徑分別為71.2和53.5 mm。然而，野生株SB11和缺失株ΔSB11在4℃和28℃條件下蛋白酶活性和腐敗代謝產(chǎn)物三甲胺、腐胺的形成無(wú)顯著差異。4℃冷藏條件下，魚(yú)汁中細(xì)菌生長(zhǎng)和揮發(fā)性鹽基氮的積累，兩株菌也無(wú)明顯不同。結(jié)果表明，luxS基因缺失減弱S.baltica的生物被膜和粘附能力，促進(jìn)泳動(dòng)性，但不影響S.baltica的致腐表型和能力。SDS-PAGE也顯示與野生株相比，缺失株中蛋白表達(dá)發(fā)生變化，其蛋白質(zhì)量主要集中在2

11、8～44.3 KDa,蛋白表達(dá)差異可能與生物被膜形成和泳動(dòng)能力的變化存在一定相關(guān)。外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)不影響S.baltica SB11的生長(zhǎng)，對(duì)生物被膜形成、泳動(dòng)、粘附能力、脂酶活性及三甲胺、揮發(fā)性鹽基氮形成卻有明顯促進(jìn)作用。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)在培養(yǎng)4h和12h后分別發(fā)現(xiàn)130個(gè)和89個(gè)顯著性差異基因，其中培養(yǎng)4h及12h的處理組與對(duì)照組相比分別共有122個(gè)及65

12、個(gè)基因上調(diào)，影響S.baltica核糖、碳代謝、脂肪酸代謝、雙組份系統(tǒng)，鞭毛組裝，細(xì)菌趨化等多條代謝通路。多種粘附相關(guān)基因，如調(diào)控細(xì)菌胞外蛋白纖維(Curli) CsgAB操縱子的轉(zhuǎn)錄管理基因、TypeⅤ菌毛的穩(wěn)定蛋白pilW基因及與熒光假單胞菌lapA同源的bpfA基因的表達(dá)均有明顯上調(diào)，可能參與促進(jìn)S.baltica SB11的粘附及定植作用。fliM、 flgD、fliA、甲基受體趨化蛋白基因等多個(gè)鞭毛及趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因上調(diào)，可

13、能參與增強(qiáng)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力。研究也發(fā)現(xiàn)，c-di-GMP合成酶二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶基因上調(diào)，該酶可以通過(guò)合成c-di-GMP促進(jìn)生物被膜形成。同時(shí)在培養(yǎng)12h后，一些腐敗相關(guān)基因如torF、torA、ODC等基因均有上調(diào)，與表型結(jié)果代謝產(chǎn)物的增加呈正相關(guān)。另外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)4h后，LuxR蛋白（蛋白序列號(hào)為AEG11800.1）對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)量顯著上升，表明該蛋白對(duì)cyclo-(L-Pro-L-

14、Leu)具有感應(yīng)，提示其可能為L(zhǎng)uxR solo蛋白。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)培養(yǎng)4h及12h后，fliA、torA和ODC基因的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果較為可靠。
　　綜上所述，腐敗菌S.baltica SB11具有AI-2及cyclo-(L-Pro-L-Leu)、cyclo-(L-Pro-L-Phe)活性，發(fā)現(xiàn)該菌存在一個(gè)LuxR家族蛋白可能為Q