中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑對U937細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、第一部分中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑對U937細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 目的:研究比較兩種中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑-GW311616A和西維來司鈉(sivelestat)對U937細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法:以U937細(xì)胞作為研究對象,分為對照組,GW311616A組和西維來司鈉組,通過MTT比色法,透射電鏡,Annexin V/PI雙標(biāo)記法,流式細(xì)胞周期分析檢測U937細(xì)胞的增殖和凋亡情況,應(yīng)用間接免疫熒光法

2、觀察細(xì)胞內(nèi)NE表達(dá),同時(shí)利用ELISA法和比色法檢測細(xì)胞內(nèi)NE含量和活性的變化。
　　 結(jié)果:兩種藥物均能抑制U937細(xì)胞的增殖,且具有一定的劑量關(guān)系,但GW311616A對它的抑制作用高于西維來司鈉,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;電鏡結(jié)果表明兩種藥物均能引起細(xì)胞凋亡;Annexin V/PI雙標(biāo)記法結(jié)果表明兩種藥物均能引起U937細(xì)胞的早期凋亡,但是GW311616A對其凋亡的影響與西維來司鈉相比更明顯,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;周期結(jié)果顯示GW

3、311616A使細(xì)胞周期阻滯于S,G2/M期,但主要阻滯于G2/M期,而西維來司鈉使細(xì)胞周期阻滯于S期;間接免疫熒光法結(jié)果表示GW311616A組熒光強(qiáng)度減弱,但西維來司鈉組熒光強(qiáng)度未明顯減弱;ELISA和比色法結(jié)果顯示兩種藥物均能使U937細(xì)胞內(nèi)NE含量和活性降低,但GW311616A對他們的影響大于西維來司鈉,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:GW311616A和西維來司鈉均能抑制U937細(xì)胞的增殖,引起其凋亡,但前者比后者

4、更有效,更能造成細(xì)胞的損傷。
　　 第二部分
　　 帶核定位信號的RARα與Ubiquilin1蛋白相互作用的驗(yàn)證
　　 目的:驗(yàn)證NLS-RARα與Ubiquilin1(UBQLN1)蛋白之間的相互作用。
　　 方法:將表達(dá)NLS-RARα誘餌蛋白和UBQLN1靶蛋白的兩種重組表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-NLS-RARα及pACT2-UBQLN1共轉(zhuǎn)化AH109酵母菌,通過酵母雙雜交技術(shù)驗(yàn)證兩者在活細(xì)胞內(nèi)的相

5、互作用;構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-UBQLN1,經(jīng)酶切鑒定后,共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,利用抗HA多克隆抗體沉淀,抗Myc單克隆抗體檢測驗(yàn)證他們之間的相互作用。
　　 結(jié)果:pGBKT7-NLS-RARα及pACT2-UBQLN1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化AH109酵母菌后,可見藍(lán)色陽性克隆;構(gòu)建的重組表達(dá)載體pCMV-HA-NLS-RARα,和pCMV-Myc-UBQLN1經(jīng)酶切鑒定成功,轉(zhuǎn)染HEK