中性粒細胞彈性蛋白酶對白血病細胞作用及其相應(yīng)機制的研究.pdf

1、本文對中性粒細胞彈性蛋白酶對白血病細胞作用及其相應(yīng)機制進行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一部分：重組慢病毒LV5-NE的構(gòu)建及其在NB4細胞中的篩選。
　　目的：構(gòu)建表達NE的慢病毒載體，在急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4細胞中過表達NE,并篩選純的表達NE的NB4細胞株。
　　方法：以質(zhì)粒pCMV-myc-NE為模板得到PCR產(chǎn)物NE的CDS區(qū)，將NE基因連接到穿梭載體pGLV10/U6/GFP/Puro后酶切

2、驗證，將序列正確的含NE質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G）同時轉(zhuǎn)染293T細胞。測定病毒滴度。實驗分為空白對照組、NB4/LV5-NC組和NB4/LV5-NE組，熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染效率。慢病毒感染NB4細胞72小時后加入終濃度1μ g/mL的嘌呤霉素（puromycin，PM）進行篩選；3天后減少PM的濃度至0.5μ g/mL，并維持此濃度繼續(xù)培養(yǎng)1周。RT-PCR和qRT-PCR鑒定NB4細胞中NE的表

3、達；western-blot進一步鑒定NE是否表達。
　　結(jié)果：酶切鑒定及測序結(jié)果表明成功構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒LV5-NE，同源重組成功，得到重組子LV5-NE；熒光顯微鏡顯示病毒包裝成功；經(jīng)過五輪擴增后，病毒滴度達到3.0×108。慢病毒感染NB4細胞后，用PM進行篩選得到純的NB4/LV5-NC和NB4/LV5-NE細胞；RT-PCR和qRT-PCR檢測到NE在NB4細胞中表達（P<0.05）；western-blot檢測到NE蛋

4、白在NB4細胞中表達（P<0.05）。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了攜NE的慢病毒載體LV5-NE，并成功感染NB4細胞，篩選得到NB4/LV5-NC和NB4/LV5-NE細胞。
　　第二部分：LV5-NE對NB4細胞增殖、凋亡和PI3K/Akt的影響。
　　目的：探討NE對人急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4生物學效應(yīng)和PI3K/Akt的影響，尋找NE致白血病的可能機制。
　　方法：實驗分為空白對照組、LV5-NC組和L

5、V5-NE組。慢病毒感染NB4細胞后，qRT-PCR檢測基因NE的表達；Western blot檢測蛋白NE的表達；CCK-8法觀察NB4細胞增殖能力；流式細胞儀測定NB4細胞周期和凋亡；qRT-PCR檢測CCD1、FOX1、mTOR、RICTOR和PTEN基因表達；Western blot檢測pAkt、Akt、Bax和Bcl-2蛋白表達。
　　結(jié)果：在NB4細胞中過表達NE后與空白對照組和LV5-NC組相比：CCK-8提示NE明

6、顯促進NB4細胞的增殖作用（P<0.05）；流式細胞術(shù)顯示NB4細胞周期阻滯在S期和G2期（P<0.05），NB4細胞凋亡減少（P<0.05）；qRT-PCR顯示基因 CCD1和 FOX1表達上調(diào),基因 mTOR、RICTOR和PTEN下調(diào)（P<0.05）；Western blot顯示pAkt和Bcl-2表達增多（P<0.05）。
　　結(jié)論：NE在NB4細胞株中過表達后可促進NB4細胞的增殖抑制其凋亡，這一效應(yīng)可能與PI3K/Ak

7、t通路中的基因和蛋白改變有關(guān)。
　　第三部分：NE對U937細胞中PI3K/Akt的影響。
　　目的：探討在U937細胞中干擾NE后對細胞PI3K/Akt通路的影響。
　　方法：siRNA-NE在脂質(zhì)體2000的輔助下轉(zhuǎn)染U937細胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率；qRT-PCR檢測基因NE表達是否下調(diào)；western-blot檢測蛋白NE表達是否下調(diào)；qRT-PCR檢測細胞CCD1、FOX1、mTOR、RICTOR和PTE

8、N基因表達； western-blot檢測pAkt、Bcl-2和Bax蛋白表達情況。
　　結(jié)果：熒光顯微鏡觀察到 siRNA-NE的轉(zhuǎn)染效率達到95％以上；qRT-PCR結(jié)果顯示基因NE表達下調(diào)（P<0.05）；western-blot結(jié)果表明NE表達明顯下調(diào)（P<0.05）；qRT-PCR結(jié)果顯示細胞基因CCD1和FOX1表達下調(diào),基因mTOR、RICTOR和PTEN上調(diào)（P<0.05）；western-blot結(jié)果顯示磷酸化蛋