利用反向重復結構轉基因及其側翼序列轉化獲得雙抗病毒轉基因煙草.pdf

1、RNA沉默在植物上稱為轉錄后基因沉默，是植物固有的一種抵御病毒侵染的機制，它可以使侵染植物的病毒的RNA發(fā)生序列特異性的降解，從而使植物獲得抗性。為提高植物對病毒的抗性，人們用來源于病毒本身的基因作為轉基因材料創(chuàng)造轉基因植物。研究證明反向重復結構轉基因在植物中有更多機會可以轉錄形成發(fā)夾結構的dsRNA，而dsRNA引發(fā)的RNA沉默在RdRp的作用下可以使沉默從雙鏈區(qū)向連接在雙鏈上的單鏈側翼序列延伸，使雙鏈及其連接在側翼的單鏈RNA序列一

2、起發(fā)生沉默。
　　 本研究通過分別在植物表達載體pRIR202反向重復結構的上游側翼插入馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）CP基因全長序列構建重組表達載體pRIR202XCP、下游側翼插入馬鈴薯X病毒基因組約2kb的單片段基因（包括CP基因至NIB基因的部分序列）構建植物表達載體pRIR202-P2kII，通過農桿菌介導方法轉化煙草；研究由反向重復結構引起的 RNA沉默能否影響到反向重復轉基因結構的側翼而獲得多

3、抗的轉基因植物。研究的主要結果和結論如下：
　　 1，構建反向重復結構側翼序列植物表達載體成功構建了植物表達載體pRIR202XCP和pRIR202-P2kII，將所構建的重組植物表達載體pRIR202XCP和pRIR202-P2kII利用液氮凍融法直接導入農桿菌LBA4404和GV3101，轉化煙草，獲得轉基因植株。
　　 2，抗病毒轉基因煙草的獲得及抗病性鑒定轉基因pRIR202XCP的植株獲得較高抗病行的轉基因煙草

4、植株，分子雜交結果證明轉基因植株的抗病性是由RNA沉默引起的，證明了由反向重復結構引發(fā)的RNA沉默可以有效的影響該重復結構上游側翼區(qū)域而同樣引發(fā)基因沉默，使轉基因植株獲得高度抗病性，從而獲得了高抗兩種病毒病的雙抗轉基因煙草植株。
　　 轉pRIR202-P2kII基因也成功獲得轉基因植株，初步的檢測證明外源基因已經轉入煙草基因組。而針對第一批移栽苗的初步抗病性測定結果表明有76％的轉基因植株表現(xiàn)出對病毒的抗性。初步說明RNA沉默