番木瓜若干果實(shí)成熟相關(guān)基因克隆及遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、番木瓜是番木瓜科(Caricaceae)番木瓜屬(Carica L.)植物，是熱帶、亞熱帶重要果樹之一。番木瓜果實(shí)屬呼吸躍變型，在18℃以上，采后果實(shí)迅速成熟、軟化。番木瓜對低溫敏感，不能冷藏運(yùn)輸，因此在運(yùn)輸和儲藏中的損失是巨大的，高達(dá)23.7％。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，延緩果實(shí)衰老的研究轉(zhuǎn)向采用基因工程培育耐儲運(yùn)新品種上。番木瓜果實(shí)成熟軟化相關(guān)基因克隆及其遺傳轉(zhuǎn)化的研究比較少，沒有見到耐儲運(yùn)新品種商業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道。為了解番木瓜果

2、實(shí)成熟的分子機(jī)理，挖掘更多更有效的果實(shí)抗軟化基因，以番木瓜不同成熟度果實(shí)為試材，采用cDNA-AFLP技術(shù)分析了果實(shí)成熟基因差異表達(dá)情況，并利用RACE技術(shù)克隆了差異表達(dá)基因。果膠裂解酶(Pectate lyase，PL)與β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase，β-Gal)都參與了果膠物質(zhì)的降解過程，與果實(shí)成熟軟化密切相關(guān)?？寺×朔竟瞎z裂解酶基因，構(gòu)建了PL反義植物表達(dá)載體以及PL與β-Gal雙價(jià)反義植物表達(dá)載體，建立了體

3、胚發(fā)生系統(tǒng)，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將兩個(gè)載體分別轉(zhuǎn)化番木瓜，獲得了抗性體胚。本研究的主要結(jié)果如下： 1番木瓜不同成熟度果實(shí)cDNA-AFLP分析 利用cDNA-AFLP技術(shù)對破色期和半黃期番木瓜果實(shí)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，獲得了50個(gè)TDFs，其中28個(gè)與Genbank數(shù)據(jù)庫中的功能基因同源，5個(gè)與未知功能的基因同源，17個(gè)未找到同源基因。經(jīng)生物信息學(xué)分析，這28個(gè)與已知功能基因同源的TDFs分別參與了果實(shí)成熟過程中基因表達(dá)調(diào)

4、控、DNA與蛋白質(zhì)合成及運(yùn)輸、蛋白質(zhì)降解、能量代謝、營養(yǎng)物質(zhì)代謝和植物逆境脅迫反應(yīng)的過程。11個(gè)與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的差異片段中，7個(gè)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，3個(gè)為轉(zhuǎn)錄因子，1個(gè)與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。 2番木瓜果實(shí)成熟差異表達(dá)基因及Actin基因的克隆與分析 采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)克隆了5個(gè)果實(shí)成熟差異表達(dá)基因和一個(gè)肌動蛋白基因，并用半定量RT-PCR分析了它們在不同成熟度番木瓜果實(shí)中的表達(dá)量差異。 克隆了番

5、木瓜過氧化物酶基因，CpPOD全長cDNA為1124 bp。序列分析發(fā)現(xiàn)，沒有起始密碼子，可能是測序錯(cuò)誤或堿基缺失造成的。不同成熟度CpPOD基因表達(dá)量分析表明，綠色期表達(dá)量很低，破色期表達(dá)量非常大，半黃和全黃時(shí)表達(dá)量有所下降。 克隆了番木瓜MYB轉(zhuǎn)錄因子，CpMYB全長cDNA為1507 bp，含有一個(gè)879 bp的開放閱讀框，編碼292個(gè)氨基酸。基因表達(dá)分析表明，CpMYB基因隨著番木瓜成熟表達(dá)量逐漸增加，衰老期又開始降低。

6、 克隆了番木瓜GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因，CpGMP全長cDNA為1544 bp。以基因組DNA為模板擴(kuò)增ORF長1775 bp，含有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子；cDNA為模板擴(kuò)增ORF長1096 bp，編碼361個(gè)氨基酸。半定量RT-PCR分析結(jié)果表明，CpGMP基因隨著番木瓜果實(shí)成熟表達(dá)量逐漸增加，軟化時(shí)又逐漸降低。 克隆了番木瓜20S蛋白酶體α亞基β蛋白基因，CpPAA1全長cDNA為1025 bp，含有一個(gè)74

7、1 bp的開放閱讀框，編碼246個(gè)氨基酸。表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，CpPAA1基因隨著番木瓜成熟表達(dá)量逐漸增加，衰老期又開始降低。 克隆了番木瓜植物類受體蛋白激酶基因3′端序列，cDNA長924 bp。表達(dá)量分析表明，綠色期表達(dá)量最高，然后隨著果實(shí)成熟和衰老表達(dá)量逐漸降低。 克隆了番木瓜肌動蛋白基因，CpActin全長cDNA為1533 bp，含有一個(gè)1134 bp的開放閱讀框，編碼377個(gè)氨基酸。 3番木瓜果實(shí)果膠裂解

8、酶基因克隆及反義植物表達(dá)載體的構(gòu)建 采用cDNA末端快速擴(kuò)增方法，獲得了番木瓜果實(shí)果膠裂解酶基因的完整3′端和部分5′端序列。然后，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得的PL基因5′端DNA序列及作者得到的3′端序列設(shè)計(jì)上、下游引物，以番木瓜基因組DNA為模板擴(kuò)增得到了PL基因的開放閱讀框。該序列長1464 bp，含有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子，編碼385個(gè)氨基酸。然后構(gòu)建了PL基因反義植物表達(dá)載體pBP，并將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。

9、 4番木瓜尸L和β-Gal基因的雙價(jià)植物反義表達(dá)載體的構(gòu)建 在番木瓜PL和β-Gal基因序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異引物，分別擴(kuò)增保守區(qū)序列，將其分別反向插入植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-35S-GUS-Nos的CaMV35S啟動子和Nos終止子之間，構(gòu)建了反義表達(dá)載體pCP和pCG。然后用兩種不同的方法將帶有完整啟動子和終止子的PL和β-Gal基因引入pCAMBIA2301中，獲得了PL和β-Gal的雙價(jià)植物反義表達(dá)載體pC

10、PG，并對兩種方法進(jìn)行了比較。 5番木瓜體胚發(fā)生系統(tǒng)的建立及遺傳轉(zhuǎn)化 以番木瓜幼胚為外植體，研究不同激素配比對胚性愈傷組織及體胚誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為改良MS+10 mg/L2，4-D+2 mg/L KT+0.5 mg/LBA+30 g/L蔗糖+400 mg/L谷氨酰胺，體胚誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為改良MS+10 mg/L2，4-D+2mg/L KT+30 g/L蔗糖+400 mg/L谷氨酰胺。利用