體外萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌演變過程及分子機制研究.pdf

1、目的:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-ResistantStaphylococcus Aureus，MRSA)自1961年被發(fā)現(xiàn)后，到80年代后期就已成為全球發(fā)生率最高的醫(yī)院內感染病原菌之一。萬古霉素一直作為治療MRSA感染的一線用藥，但近年來萬古霉素治療失敗的病例日益增多，導致MRSA治療成為臨床關注的熱點，國外部分地區(qū)已出現(xiàn)對萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌(Vancomycin-resistant Staphyloc

2、occusaureus)和萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌(Vancomycinintermediate-resistant staphylococcus aureus，VISA)，本課題組前期研究表明我國南方地區(qū)MRSA對萬古霉素的MIC有逐年上升的趨勢，深入了解MRSA對萬古霉素耐藥機制，有助于提高我們對MRSA耐藥性的認識。
　　本研究通過體外誘導萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌，從遺傳背景和耐藥基因突變方面對萬古霉素中介耐藥金

3、黃色葡萄球菌進行研究，旨在探討萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌的發(fā)生機制。
　　本研究分為兩部分，第一部分實驗室誘導萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌的表型特征和遺傳背景變化;基于第一部分研究的發(fā)現(xiàn):一株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌演變?yōu)槿f古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌過程中丟失了mecA基因，也就是苯唑西林的耐藥性，則第二部分對萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌mecA基因丟失的分子機制進行研究。
　　方法:通過低濃度萬古霉素逐步誘導臨床

4、MRSA菌株，MIC檢測菌株對萬古霉素和苯唑西林的耐藥性，PCR檢測菌株mecA基因，PFGE驗證誘導株和親本株的同源性，MLST和SCCmec分型分析VISA的相關性。對實驗室誘導的VISA和親本株VSSA進行PCR檢測雙組份系統(tǒng)VraSR、GraRS、WalKR以及rpoB基因，測序分析有無氨基酸改變。通過PFGE方法對缺失mecA基因的VISA菌株和其VSSA菌株進行分析，多位點PCR確定缺失片段的位置，PCR連接缺失位點兩端，測

5、序分析缺失位點周圍基因環(huán)境。
　　結果:通過誘導實驗，14株臨床分離的MRSA中有12株達到VISA水平，其中2株ST239-SCCmecⅢ、2株ST5-SCCmecⅡ和1株新SCCmec型MRSA萬古霉素MIC達到8-10ug/ml。脫離萬古霉素后，10株菌對萬古霉素的MIC都可回復至敏感限(≤2ug/ml)，有兩株菌(4126，3503)在連續(xù)傳代20天后對VAN的MIC仍未回復，PFGE證實這兩株菌為同一克隆，其中菌株350

6、3誘導后表現(xiàn)出對苯唑西林敏感，PCR證實mecA基因陰性，誘導成功的大部分VISA對苯唑西林的MIC下降。一株VISA的rpoB第862位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，未在VISA中發(fā)現(xiàn)VraSR、GraRS、WalKR雙組份調控系統(tǒng)的突變。菌株3503在誘導到萬古霉素MIC等于6ug/ml時發(fā)生SCCmec(Staphylococcus cassettechromosome mec，SCCmec)基因島片段丟失，丟失片段為包含mecA基因的40

7、kb左右的SCCmec基因，當其萬古霉素MIC升高至10ug/ml時，又出現(xiàn)大約40kb的DNA丟失，兩次DNA片段丟失均位于轉座子IS131的下游。
　　結論:臨床分離的MRSA在體外較易誘導為VISA，大多數(shù)VISA不穩(wěn)定，可回復為VSSA。VISA產(chǎn)生萬古霉素耐藥的同時可能伴隨苯唑西林敏感性增加，甚至因mecA基因丟失而恢復敏感?；騬poB突變可能參與VISA的形成。VISA的形成過程中可出現(xiàn)SCCmec基因島及其周圍的D