耐萬古霉素腸球菌檢測基因芯片方法的建立和驗證.pdf

1、腸球菌屬于革蘭氏陽性球菌，它廣泛分布于自然環(huán)境及人和動物的消化道內，其致病力較弱，只有在宿主組織寄殖，耐機體非特異及免疫防御機制，并引起病理改變才能導致感染。但是由于近年來在臨床中廣譜抗生素尤其是萬古霉素的大量使用以及在使用中的不合理現(xiàn)象，導致了耐萬古霉素腸球菌(VRE)的出現(xiàn)，從而引起了全世界范圍內的廣泛關注。近年來大量研究顯示，由于VRE更容易引起院內感染及播散，其檢測、鑒別與診斷也成為了醫(yī)務工作者及研究者們所面臨的重要問題。目前常

2、用VRE的檢測方法為細菌學方法，其使用耗時且無法準確辨別腸球菌的菌種類型;并且腸球菌屬中不同種細菌對抗菌藥物的耐藥性存在差異，其也無法區(qū)分VRE的耐藥基因。相對于藥敏實驗的不足，本研究選取了2種常見的腸球菌，旨在應用基因芯片檢測技術研制可以區(qū)分VRE種類及耐藥基因型的基因芯片，為深入開展基因芯片檢測VRE更廣泛應用于臨床奠定基礎。我們以16S rDNA基因作為檢測靶片段，耐萬古霉素特異性基因及腸球菌的特異性基因作為靶序列，根據(jù)GeneB

3、ank中查找到的2種常見腸球菌特異性基因序列（ddl）及萬古霉素耐藥基因（VanA，VanB），利用BLAST等比對軟件，設計與合成用于檢測腸球菌的特異性基因及耐藥基因的引物和探針，制備耐萬古霉素腸球菌檢測基因芯片。利用多重不對稱PCR法擴增樣品中的特異性基因與耐藥基因片段，標記產物與基因芯片上的探針雜交，經(jīng)清洗、化學發(fā)光法顯色后進行結果分析。在優(yōu)化的多重PCR體系、雜交反應和化學發(fā)光法檢測條件下，評價芯片的特異性、靈敏性和重復性等性能

4、指標，并應用于臨床樣本的檢測。最后本研究所選取的靶耐藥基因和腸球菌特異性基因為耐萬古霉素A基因（VanA）、耐萬古霉素B基因（VanB）、腸球菌特異性基因(ddl)，16S rDNA基因作為內對照，共篩選出1對通用引物、4對特異性引物和1條細菌通用探針、4條特異性檢測探針。確定了五重PCR體系。確定了每種探針的cutoff值。檢測耐萬古霉素腸球菌的靈敏度為103cfu/mL，批間和批內變異系數(shù)CV值均小于15％。對40例臨床樣本進行檢測