低水平萬(wàn)古霉素耐藥金黃色葡萄球菌生物膜形成及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（金葡菌）是臨床常見的條件致病菌，致病力強(qiáng)，可引起輕微的皮膚軟組織感染，也可引起威脅生命的中毒性休克綜合征、敗血癥、骨髓炎等多種疾病。金葡菌極易產(chǎn)生耐藥性，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）最為常見。萬(wàn)古霉素是目前臨床治療MRSA感染的首選藥物，也被認(rèn)為是抵御革蘭陽(yáng)性菌感染的最后一道防線。但隨著萬(wàn)古霉素用量的增加，近年來出現(xiàn)了萬(wàn)古霉素耐藥的金葡菌。盡管目前對(duì)萬(wàn)古霉素完全耐藥（高水平耐藥）的金葡菌仍非常罕見，但越來越多

2、的文獻(xiàn)報(bào)道檢出低水平萬(wàn)古霉素耐藥金葡菌，包括萬(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌（VISA）和萬(wàn)古霉素異質(zhì)性中介耐藥金黃色葡萄球菌（hVISA）。與萬(wàn)古霉素耐藥金黃色葡萄球菌（VRSA）不同，hVISA/VISA沒有明確的耐藥基因介導(dǎo)，而是金葡菌在萬(wàn)古霉素選擇壓力下產(chǎn)生的適應(yīng)性耐藥，常伴有細(xì)胞壁增厚、生長(zhǎng)緩慢、毒力減低等適應(yīng)性改變。這些變化可導(dǎo)致萬(wàn)古霉素滲透障礙，細(xì)菌難以被清除，感染反復(fù)發(fā)作，增加了臨床治療的難度。生物膜是細(xì)菌抵御抗菌藥物和宿

3、主免疫攻擊的胞外屏障，與金葡菌耐藥和致病密切相關(guān)。hVISA/VISA生物膜形成是否也發(fā)生了改變尚存爭(zhēng)議，本課題重點(diǎn)對(duì)hVISA/VISA生物膜形成能力和機(jī)制開展研究。
　　目的：本研究旨在明確hVISA/VISA生物膜形成能力是否發(fā)生改變。研究生物膜形成與耐藥之間的相關(guān)性，探討生物膜形成機(jī)制和分子調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)hVISA/VISA的生存方式和致病特征。
　　方法：（1）利用含3μg/ml萬(wàn)古霉素的腦心

4、浸液（BHI）瓊脂平板（BHI-V3）篩選臨床分離的金葡菌中萬(wàn)古霉素低水平耐藥菌株，對(duì)兩組細(xì)菌的遺傳背景、生物膜形成能力進(jìn)行比較。（2）隨機(jī)選擇一株可以在BHI-V3平板上生長(zhǎng)的萬(wàn)古霉素低水平耐藥菌株0534用萬(wàn)古霉素進(jìn)行體外誘導(dǎo)，使其MIC值逐步升高，獲得系列萬(wàn)古霉素梯度耐藥的菌株。用微孔成膜法及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)菌株的生物膜形成能力。（3）應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)0534及其系列誘導(dǎo)菌株的生物膜形成調(diào)控相關(guān)基因

5、（icaA、icaR、fnbA、SarA、agr、atlA和lrgAB）及耐藥調(diào)控二元信號(hào)系統(tǒng)VraSR轉(zhuǎn)錄水平。（4）使用免疫斑點(diǎn)印記法測(cè)定細(xì)菌的胞外多糖粘附素（PIA）產(chǎn)生能力。（5）利用凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）檢測(cè)與金黃色葡萄球菌生物膜形成基因（icaA、icaR和fnbA）及調(diào)控基因（Agr、atlA和SarA）啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況。DNase I足跡印記實(shí)驗(yàn)鑒定VraR蛋白與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)果：（1

6、）本研究共收集臨床分離的金葡菌176株。其中16株金葡菌可在BHI-V3篩選平板上生長(zhǎng)，命名為 GV3。經(jīng)鑒定這16株菌株均為MRSA。故我們隨機(jī)挑選16株不在BHI-V3篩選平板上生長(zhǎng)的MRSA菌株作為對(duì)照組，命名為NGV3組。兩組菌株遺傳背景基本一致，多為 agr II、SCCmec III、t030型。微孔成膜法檢測(cè)顯示，所有GV3菌株均可形成明顯的紫色斑狀固著物，而NGV3組僅有部分菌株可形成一層薄薄的紫色固著物。結(jié)晶紫染色半定

7、量分析顯示，GV3組菌株平均吸光度值明顯高于NGV3組（0.336±0.088 Vs0.109±0.036）。
　?。?）0534菌株經(jīng)過萬(wàn)古霉素體外傳代誘導(dǎo)后，可獲得系列不同萬(wàn)古霉素耐藥水平的菌株，最高萬(wàn)古霉素MIC值可達(dá)32μg/ml。與原代菌株相比，系列萬(wàn)古霉素梯度耐藥菌株均可形成紫色斑狀固著物，并且隨著萬(wàn)古霉素MIC值的升高，顏色逐漸加深。結(jié)晶紫染色半定量分析顯示，誘導(dǎo)菌株0534-V8（1.74±0.10）、0534-V

8、16（2.23±0.07）和0534-V32（2.85±0.05）平均吸光度值明顯高于原代菌株0534（0.41±0.03）。激光共聚焦顯微鏡觀察菌株生物膜三維立體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)較之原代菌株0534，系列萬(wàn)古霉素梯度耐藥菌株均形成了緊湊的、厚的生物膜。其中，0534-V32菌株生物膜平均厚度為12±0.7μm，遠(yuǎn)大于0534菌株生物膜平均厚度（2±0.4μm)。
　　（3）qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與NGV3組菌株相比，GV3菌株

9、icaA和 fnbA轉(zhuǎn)錄水平分別增高了1.67倍和3.44倍。而icaR和agr轉(zhuǎn)錄水平下降了1.88倍和2.18倍。與原代菌株相比，系列萬(wàn)古霉素梯度耐藥誘導(dǎo)株 icaA、fnbA、atlA和 sarA轉(zhuǎn)錄水平均明顯上升，而icaR、agr轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。且基因表達(dá)水平的變化與菌株萬(wàn)古霉素MIC升高的程度密切相關(guān)。
　　（4）相較之于原代菌株，系列萬(wàn)古霉素耐藥誘導(dǎo)株的PIA表達(dá)均明顯增高。其中0534-V32菌株P(guān)IA表達(dá)量是0

10、534菌株的5.31倍。且PIA表達(dá)水平增高與菌株萬(wàn)古霉素MIC升高的程度密切相關(guān)。
　?。?）與NGV3組菌株相比，GV3菌株耐藥相關(guān)雙組份調(diào)控系統(tǒng)VraSR轉(zhuǎn)錄水平增高了2.20倍。與原代菌株相比，系列萬(wàn)古霉素梯度耐藥誘導(dǎo)株VraSR轉(zhuǎn)錄水平均明顯上升，與促生物膜形成基因（icaA、fnbA、atlA和 sarA）表達(dá)量呈正相關(guān)，與抑制生物膜形成的icaR、agr表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。使用重組表達(dá)并純化的rVraR蛋白，進(jìn)行凝膠遷移

11、阻滯實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示VraR不能與fnbA、icaADBC、sar、atlA基因的啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合。但可以與Agr啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合。DNase I足跡印記實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證表明VraR與agr啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)位于P2和P3啟動(dòng)子之間。
　　結(jié)論：（1）hVISA/VISA生物膜形成增加，且隨著萬(wàn)古霉素MIC值升高，生物膜形成能力逐漸增強(qiáng)。（2）hVISA/VISA可通過FnbA高表達(dá)和PIA依賴途徑促進(jìn)生物膜形成。（3）萬(wàn)古霉素耐