雜色曲霉素、乙醇聯(lián)合染毒致人肝細(xì)胞Hep G2 DNA鏈斷裂機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究發(fā)現(xiàn)雜色曲霉素(Sterigmatocystin，ST)作為繼黃曲霉毒素之后的第二大真菌毒素，廣泛存在于自然界中，可污染多種糧食作物，在ST污染嚴(yán)重的地區(qū)，居民患有胃癌和肝癌的機(jī)率高于其他地區(qū)。而乙醇的攝入在近些年來(lái)也逐漸增加，長(zhǎng)期大量的飲酒可誘發(fā)多種疾病，尤其是肝損害。在日常生活中，人們可能同時(shí)攝入兩種物質(zhì)，我們猜想是否有毒物質(zhì)的聯(lián)合攝入比單一攝入對(duì)身體健康傷害更大。因此，本實(shí)驗(yàn)以體外實(shí)驗(yàn)為研究手段，探究乙醇和ST的聯(lián)合處理

2、是否可增加這2種毒物肝損傷程度;并從氧化應(yīng)激和溶酶體膜穩(wěn)定性?xún)蓚€(gè)方面來(lái)探討其DNA損傷的機(jī)制。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)體系選定人肝細(xì)胞HepG2，實(shí)驗(yàn)步驟如下:1.采用MTT細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)，確定染毒劑量;金正均法計(jì)算合并效應(yīng)相關(guān)系數(shù)，確定兩者相互作用關(guān)系。2.采用單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞DNA的損傷狀況;用Hoechst33258染色檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡。3.采用2'，7'二氫二氯熒光素(DCFH)染色法檢測(cè)HepG2

3、細(xì)胞中ROS的水平。4.熒光色素吖啶橙(Acridineorange，AO)染色法測(cè)定HepG2細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜的穩(wěn)定性。5.應(yīng)用SPSSv11.5統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ST的IC50為10.1μg/mL，乙醇的IC50為1190.4μg/mL。乙醇240μg/mL和ST1μg/mL聯(lián)合作用處理HepG2細(xì)胞24h后，聯(lián)合系數(shù)為q=0.99，呈單純相加作用。2.HepG2細(xì)胞在ST0

4、.5、1和2μg/mL分別處理0.5、1和2h，乙醇60、120和240μg/mL分別處理1h后引起DNA斷裂，細(xì)胞出現(xiàn)彗星樣的拖尾，尾長(zhǎng)的增長(zhǎng)同對(duì)照組相比呈劑量依賴(lài)關(guān)系，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合處理0.5h后HepG2細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)DNA損傷。ST和乙醇聯(lián)合作用2h處理后，細(xì)胞損傷程度加劇且細(xì)胞凋亡的數(shù)量大于10％。3.ST、乙醇單獨(dú)處理HepG2細(xì)胞0.5h后可引起ROS生成量增加，聯(lián)合處理組ROS的生成量與單獨(dú)乙醇處理組相比增加。4.

5、HepG2細(xì)胞在ST單獨(dú)處理1h或乙醇處理0.5h后，溶酶體膜穩(wěn)定性開(kāi)始發(fā)生變化。在不同劑量乙醇中聯(lián)合使用1μg/mLST染毒1h，可測(cè)得的細(xì)胞AO熒光強(qiáng)度達(dá)到頂峰，2h聯(lián)合染毒處理組時(shí)發(fā)生回落，總體較乙醇單獨(dú)染毒處理組有顯著性差異。
　　 結(jié)論:與乙醇單獨(dú)作用相比，雜色曲霉素和乙醇的混合處理會(huì)降低細(xì)胞存活率，增加HepG2細(xì)胞DNA鏈斷裂程度，加劇DNA損傷。其作用機(jī)制可能是乙醇和ST聯(lián)合作用均可造成細(xì)胞損傷且其損傷一部分原因

6、與溶酶體途徑以及氧化應(yīng)激途徑有關(guān)。ST和乙醇聯(lián)合處理可引起細(xì)胞內(nèi)ROS的和AO熒光值強(qiáng)度的增加，且增加量與時(shí)間和劑量有一定的依賴(lài)關(guān)系。聯(lián)合染毒處理2h后，細(xì)胞損傷繼續(xù)加劇，與乙醇單獨(dú)處理組相比，ROS生成量和AO熒光強(qiáng)度沒(méi)有顯著增加，AO熒光強(qiáng)度反而比乙醇單獨(dú)作用減少，可能與凋亡細(xì)胞增多有關(guān)，這在彗星實(shí)驗(yàn)中也得到驗(yàn)證。因此ST和乙醇聯(lián)合處理HepG2細(xì)胞誘發(fā)DNA損傷加劇的原因可能一部分來(lái)自于氧化應(yīng)激作用，一部分來(lái)自與溶酶體破裂對(duì)細(xì)胞D