乙肝病毒X蛋白對肝癌HepG2細(xì)胞DNA雙鏈斷裂修復(fù)的影響.pdf

1、研究表明乙型肝炎病毒（HBV）是引起原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的最主要病因之一，乙型肝炎病毒X蛋白(HBVx)是乙肝病毒基因翻譯的重要蛋白之一。在乙肝病毒相關(guān)性肝癌的發(fā)生過程中，HBVx 作為促腫瘤的輔助因子扮演著多種角色。腫瘤發(fā)生的起始大多來自于各種原因引起的DNA損傷，其中HBVx 能刺激細(xì)胞線粒體產(chǎn)生氧應(yīng)激反應(yīng)（ROS），導(dǎo)致氧自由基等有害物質(zhì)增多，引起不同程度的DNA損傷包括DNA雙鏈斷裂(DSBs)。宿主對DSBs 正確修復(fù)過程如果受到

2、某些干擾或采用不恰當(dāng)?shù)男迯?fù)方式，則可能會導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定或?qū)?dǎo)致乙肝病毒DNA片段的整合，普遍認(rèn)為這是乙型肝炎相關(guān)性肝癌發(fā)生的重要步驟之一。然而目前，HBVx 對DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制的影響還有待深入的研究。
　　 目的:研究乙型肝炎病毒X蛋白（HBVx）對藥物博萊霉素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞DNA雙鏈斷裂(DSBs)損傷修復(fù)的影響，包括細(xì)胞周期的變化及對DSB 損傷同源重組修復(fù)關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白CtIP的影響。為研究HBVx 對肝細(xì)胞D

3、SB 損傷修復(fù)干擾的分子機(jī)制及乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)病機(jī)制探索新的研究思路。
　　 方法:建立穩(wěn)定表達(dá)HBVx 蛋白的HepG2 肝癌細(xì)胞株,同時(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作為對照；分別檢測藥物博萊霉素誘導(dǎo)兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染基因細(xì)胞株DSB 損傷后的生物學(xué)改變，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況，分別使用Real-time PCR及Western blot方法檢測DSB 損傷后HR 修復(fù)調(diào)控蛋白CtIP的mRNA與蛋白表達(dá)水平，并用免疫共聚焦顯微

4、鏡觀察CtIP 蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位表達(dá)情況，研究乙肝病毒X 蛋白對DSB 損傷修復(fù)的影響。
　　 結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乙型肝炎病毒X基因的HepG2細(xì)胞株能穩(wěn)定表達(dá)HBVx蛋白，對DSB 損傷敏感性增強(qiáng)。細(xì)胞凋亡檢測顯示，藥物處理后，HBVx 蛋白穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞株相比較于對照細(xì)胞株細(xì)胞凋亡數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）,但死亡細(xì)胞數(shù)更多且有顯著性差異(P＜0.05),未用藥物處理的兩組細(xì)胞株細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡均無顯著性差

5、異(P＞0.05)。細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，HBVx 蛋白的表達(dá)使細(xì)胞周期S 期縮短，G2 期細(xì)胞增多；藥物處理后兩種細(xì)胞株都出現(xiàn)了細(xì)胞周期G2/M 期阻滯，HBVx蛋白穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞株相比較于對照細(xì)胞株出現(xiàn)更多細(xì)胞周期G2/M期阻滯且有顯著性差異（P＜0.05）。另外，通過蛋白Western Blot 檢測分析，發(fā)現(xiàn)乙肝病毒X 蛋白干擾了抑癌基因CtIP的蛋白表達(dá)，使CtIP 蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05），用Real-timeP

6、CR方法檢測CtIP 蛋白mRNA 水平下調(diào)（P＜0.05），同時(shí)免疫共聚焦顯微鏡觀察到CtIP 蛋白在細(xì)胞核內(nèi)定位聚集情況。
　　 結(jié)論:我們的研究表明，HBVx蛋白能通過干擾腫瘤抑制蛋白CtIP的表達(dá)影響細(xì)胞DSB 損傷的修復(fù)，這可能損傷細(xì)胞同源重組修復(fù)能力，促使肝細(xì)胞過多采取易發(fā)生堿基丟失和錯(cuò)配的非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)的方式進(jìn)行DSB 損傷修復(fù)，甚至導(dǎo)致HBV基因片段整合到肝細(xì)胞基因組中，從而引起肝細(xì)胞的死亡或基因