喹乙醇誘導(dǎo)HEK-293細(xì)胞DNA鏈斷裂損傷產(chǎn)生氧化應(yīng)激及溶酶體線粒體相關(guān)機(jī)制探討.pdf

1、目的:喹乙醇是一種人工合成的抗菌促生長劑，因其具有效率高、毒性低、殘留少等特點，在中國作為飼料添加劑廣泛使用。喹乙醇藥物毒性作用原理和相關(guān)機(jī)制尚不明確，對藥物使用劑量范圍沒有明確規(guī)定。由于喹乙醇藥物使用不當(dāng)，大量動物中毒死亡事件時有發(fā)生，直接或間接危及人類健康。本試驗對喹乙醇誘導(dǎo)人胚腎HEK-293細(xì)胞毒性相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測，通過觀察細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和溶酶體、線粒體膜穩(wěn)定性的改變，從而探討喹乙醇對DNA鏈斷裂損傷可能遺傳毒性機(jī)制，為進(jìn)一

2、步評估喹乙醇對人類健康的影響提供試驗依據(jù)。
　　方法:在本次試驗中，選擇人胚腎HEK-293細(xì)胞為研究對象，通過單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)試驗技術(shù)檢測并觀察喹乙醇對細(xì)胞DNA的損傷情況;WesternBlotting免疫印記技術(shù)用于檢測DNA損傷相關(guān)蛋白p53的表達(dá)水平;Real-timePT-PCR技術(shù)用于檢測DNA損傷相關(guān)基因ATM和p53的表達(dá)水平。為探討其可能的遺傳毒性機(jī)制，熒光分光光度計對以下指標(biāo)進(jìn)行檢測:吖啶橙(AO)

3、染色法用于檢測細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性;2'，7'—二氫二氯熒光素(DCFH-DA)染色法用于檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平;苯二醛(OPT)染色法用于檢測細(xì)胞內(nèi)GSH水平;羅丹明123(Rhodamine123)染色法用于檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位。地昔帕明(50μM)和N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine，NAC)(10 mM)分別作為溶酶體膜穩(wěn)定性和氧化損傷的保護(hù)劑，對HEK-293細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，為探討喹乙醇誘導(dǎo)HEK-293細(xì)胞D

4、NA鏈斷裂損傷相關(guān)途徑機(jī)制提供依據(jù)。試驗結(jié)果用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:HEK-293細(xì)胞經(jīng)不同濃度喹乙醇(200、400、800μg/ml)藥物處理2h，試驗結(jié)果分析得出:尾長(Tail Length)分別為42.88μm，74.10μm，84.16μm;尾DNA百分含量(Tail DNA％)分別為34.06％，36.30％，50.83％;尾矩(Tailmoment)分別為15.69μm％，28.72μm％，43

5、.95μm％，與空白對照組比較，200-800μg/ml藥物處理組均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)且呈劑量依賴關(guān)系。喹乙醇(200，400，800μg/ml)作用細(xì)胞2h，與空白對照組比較，細(xì)胞內(nèi)AO的熒光強(qiáng)度分別增加了24.66％，34.93％，48.07％(P＜0.05，P＜0.01);濃度為800μg/ml藥物處理組ROS水平升高了67.89％（P＜0.01）;濃度為400μg/ml和800μg/ml藥物處理組GSH水平分別下降了2

6、6.92％和41.58％(P＜0.01)。喹乙醇(200，400，800μg/ml)作用細(xì)胞12h，與空白對照組比較，濃度為400μg/ml和800μg/ml藥物處理組細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位分別下降了30.08％和44.95％（P＜0.01）;濃度為400μg/ml和800μg/ml藥物處理組p53蛋白表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)，p53和ATM基因的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)，呈劑量依賴關(guān)系。地昔帕明(50μM)預(yù)處理HEK-29

7、3細(xì)胞1h，與喹乙醇（800μg/ml）單獨染毒劑量組相比，細(xì)胞內(nèi)AO熒光強(qiáng)度下降了42.21％(P＜0.01);NAC(10 mM)預(yù)處理HEK-293細(xì)胞1h，與喹乙醇（800μg/ml）單獨染毒劑量組相比，ROS水平下降了36.74％(P＜0.01)，而GSH水平相對升高了70.65％(P＜0.01);兩種保護(hù)劑的干預(yù)都可以有效減輕喹乙醇引起的DNA鏈斷裂損傷，使彗星拖尾明顯減小。
　　結(jié)論:喹乙醇可以誘導(dǎo)人胚腎HEK-29

8、3細(xì)胞DNA損傷，使DNA損傷相關(guān)蛋白p53和損傷基因ATM、p53表達(dá)上調(diào)。喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷的作用機(jī)制與溶酶體途徑有關(guān):喹乙醇通過改變?nèi)苊阁w膜通透性，釋放一些酸性水解酶，從而導(dǎo)致DNA損傷。地昔帕明作為酸性鞘磷脂酶的抑制劑，通過抑制溶酶體的水解酶類，從而保護(hù)溶酶體膜穩(wěn)定性，抑制p53蛋白的表達(dá)，減輕喹乙醇誘發(fā)的DNA鏈斷裂損傷;喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷與細(xì)胞內(nèi)氧化損傷有關(guān):NAC作為一種有效的抗氧化劑，可以降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水

9、平，升高GSH水平，使p53蛋白表達(dá)量減少，從而抑制喹乙醇對HEK-293細(xì)胞DNA損傷;喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷與線粒體途徑有關(guān):喹乙醇可以通過降低線粒體膜穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致DNA鏈斷裂損傷。通過時間點試驗驗證，喹乙醇作用HEK-293細(xì)胞2h可以引起溶酶體膜穩(wěn)定性的改變并使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，而線粒體膜穩(wěn)定性未發(fā)生明顯變化;藥物作用時間延長至12h，細(xì)胞線粒體膜穩(wěn)定性顯著下降。由此推出:喹乙醇誘導(dǎo)HEK-293細(xì)胞DNA鏈斷裂損傷，