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1、目的:miRNA在控制發(fā)育進(jìn)程、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及器官發(fā)育等扮演著關(guān)鍵性角色,本課題組前期研究確認(rèn)了下調(diào) Gremlin1的表達(dá)可抑制HSC-T6的活化,進(jìn)而逆轉(zhuǎn)CCL4誘導(dǎo)的SD大鼠肝纖維化模型的纖維化進(jìn)程。本課題的研究目的主要是篩選并確認(rèn)HSC-T6中下調(diào)Gremlin1表達(dá)的miRNA,以及該miRNA抑制HSC活化的能力。
方法:⑴運(yùn)用生物信息學(xué)軟件篩選出可能下調(diào)Gremlin1表達(dá)的miRNA;⑵用熒光素酶報(bào)告基
2、因分析法將 Gremlin1的 mRNA的3′-UTR全長(zhǎng)及部分片段轉(zhuǎn)染HSC-T6,通過熒光素酶的活性篩選下調(diào)Gremlin1表達(dá)的miRNA的結(jié)合區(qū)域;⑶結(jié)合生物信息學(xué)軟件和熒光素酶報(bào)告基因分析法篩選可能下調(diào) Gremlin1表達(dá)的miRNA;⑷合成篩選出的miRNA Mimic,將其轉(zhuǎn)染HSC-T6中,通過western blot方法驗(yàn)證miRNA對(duì)Gremlin1的下調(diào)作用,以及對(duì)肝纖維化相關(guān)基因(膠原蛋白、TGF-β、α-SM
3、A)表達(dá)的影響。
結(jié)果:①運(yùn)用生物信息學(xué)軟件篩選出可能下調(diào)Gremlin1表達(dá)的6種保守miRNA;②用熒光素酶報(bào)告基因分析法篩選出下調(diào)Gremlin1表達(dá)的miRNA的結(jié)合區(qū);③結(jié)合生物信息學(xué)軟件和熒光素酶報(bào)告基因分析法篩選可能下調(diào)Gremlin1表達(dá)的保守miRNA有:miR-23a/b、miR-27a/b、miR-181a/b/c/d和miR-182;④合成篩選出的miRNA Mimic,轉(zhuǎn)染HSC-T6后,確認(rèn)了miR
4、-23b-3p、miR-27b和miR-182能下調(diào)HSC-T6中Gremlin1的表達(dá);miR-181b-1-3p能下調(diào)Collα1和Col1α2的表達(dá);⑤miR-27b既能下調(diào)HSC-T6中Gremlin1的表達(dá),又能下調(diào)HSC-T6中α-SMA、TGF-β、Col1α1和Col1α2的表達(dá)。
結(jié)論:Gremlin1通過調(diào)節(jié)BMP-7/TGF-β-Smad信號(hào)通路,對(duì)HSC的活化起著促進(jìn)作用,下調(diào)Gremlin1的表達(dá)可抑
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