姜黃素抑制肝星狀細(xì)胞活化的分子機(jī)理研究.pdf

1、肝纖維化是肝臟受到各種慢性損傷的愈合過程，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)生成超過它的降解。如果早期沒有得到有效的治療，可逆性肝纖維化就會發(fā)展成為不可逆的肝硬化。肝纖維化是各種慢性肝病共同的病理過程。肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，正常時HSC呈靜息及非增殖狀態(tài)，但在肝組織損傷的情況下，HSC激活并轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，細(xì)胞大量增殖和ECM的合成增加并沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。姜黃素是姜黃屬植物姜黃根莖的活性成分，具有抗

2、增殖、抗氧化、抗炎、抗血管生成和抗癌作用。文獻(xiàn)報道姜黃素可以顯著抑制HSC活化，減少細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制ECM基因表達(dá)，但其確切的作用機(jī)制還不十分明了，若能闡明其關(guān)系，有助于使姜黃素成為有潛力的以HSC為靶點的抗肝纖維化備選藥物。 第一部分 姜黃素誘導(dǎo)活化肝星狀細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)的作用依賴于過氧化物酶增殖因子活化受體-γ的激活 目的：研究姜黃素對活化HSC中PPAR γ的激活在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制EC

3、M基因表達(dá)過程中的作用及其機(jī)制。 方法：傳代的HSC細(xì)胞按實驗設(shè)計方法處理后，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法(westem blotting)分析，Caspase3活性測定，流式細(xì)胞儀分析凋亡HSC，實時PCR(Real-time PCR)檢測，質(zhì)粒及瞬時轉(zhuǎn)染分析，TGF-β1免疫測定。 結(jié)果：PPAR γ的激活介導(dǎo)了姜黃素抑制cyclin D1的表達(dá)，而cvclin D1表達(dá)的抑制又促進(jìn)PPAR Y的激活，姜黃素還通過刺激體外活化H

4、SC中Caspase3活性、增加促凋亡Bax數(shù)量和降低抗凋亡Bcl-2水平而促使HSC細(xì)胞凋亡。此外，PPAR Y的激活是姜黃素抑制 ECM基因表達(dá)所必需的，PPAR Y的激活通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF_β)受體介導(dǎo)了姜黃素阻斷TGF-β信號傳導(dǎo)通路。 結(jié)論：姜黃素激活體外活化HSC中PPAR Y的活性，從而起到抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制ECM基因表達(dá)的作用。 第二部分 姜黃素抑制結(jié)締組織生長因子基因的表達(dá)而抑

5、制活化肝星狀細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá) 目的：研究姜黃素抑制活化的HSC中α1(Ⅰ)型膠原基因[α1(Ⅰ)collagen]表達(dá)機(jī)制。 方法：傳代的HSC細(xì)胞按實驗設(shè)計方法處理后，進(jìn)行Westernblotting， Real-time PCR檢測，質(zhì)粒及瞬時轉(zhuǎn)染分析，GSH免疫測定。 結(jié)果：姜黃素能減少活化HSC中結(jié)締組織生長因子(CTGF)并抑制它的基因表達(dá)。外源性CTGF能消除姜黃素的抑制效應(yīng)。姜黃素通過激

6、活過氧化物酶增殖因子活化受體(PPAR-γ)來抑制CTGF基因表達(dá)而阻斷轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)信號。姜黃素抗氧化活性是通過顯著升高谷胱甘肽(GSH)水平和活化的HSC中GSH與GSSG的比例。細(xì)胞GSH合成是姜黃素阻斷TGF-β信號和抑制活化HSC中CTGF及α1(Ⅰ)collagen基因表達(dá)的先決條件。 結(jié)論：姜黃素抑制活化HSC中αl(Ⅰ)collagen基因表達(dá)是通過增高細(xì)胞GSH含量和阻斷TGF-β信號并抑制CTGF

7、基因表達(dá) 第三部分 姜黃素干擾轉(zhuǎn)化生長因子-β信號傳導(dǎo)從而誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞中過氧化物酶增殖子活化受體-γ的基因表達(dá) 目的：研究在HSC中PPAR-γ活化與TGF-β信號傳遞相互拮抗作用的機(jī)制。 方法：傳代的HSC細(xì)胞按實驗設(shè)計方法處理后，進(jìn)行Westemblotting，Real-time PCR檢測，質(zhì)粒及瞬時轉(zhuǎn)染分析，位點定向突變實驗，電泳遷移率移動分析(EMSA分析)。 結(jié)果：外源性的TGF-β1

8、抑制活化HSC中PPAR-γ基因的表達(dá)，但姜黃素的預(yù)處理會完全阻止此抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過干擾TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)染實驗進(jìn)一步表明用顯性負(fù)相PdnTGF-RⅡ受體阻斷TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)會增加PPAR-γ基因啟動子活性。啟動子缺失檢測，位點定向突變和凝膠移動檢測將姜黃素的反應(yīng)位點集中定位于PPAR-γ基因啟動子上的兩個Smad結(jié)合元素(Smad binding elements，SBEs)，負(fù)向調(diào)節(jié)傳代的HSC啟動子的活性。Sm