siRNA抑制IGFBPrP1表達(dá)對(duì)活化肝星狀細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的影響.pdf

1、本文分三部分，第一部分siRNA對(duì)肝星狀細(xì)胞IGFBPrP1基因表達(dá)的抑制
　　 目的:設(shè)計(jì)、化學(xué)合成2對(duì)針對(duì)大鼠胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1(IGFBPrP1)基因的siRNA，研究對(duì)大鼠IGFBPrP1基因和蛋白表達(dá)的抑制作用，篩選出抑制作用較顯著的一對(duì)IGFBPrP1 siRNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)中IGFBPrP1功能的研究。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用10、30、5

2、0nmol/L化學(xué)合成的FAM-Negative siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h應(yīng)用熒光顯微鏡評(píng)估其轉(zhuǎn)染效率。
　　 2.30nmol/L IGFBPrP1 siRNA(siRNA1、siRNA2)和陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)HSC-T6中IGFBPrP1基因的表達(dá)(β-actin作為內(nèi)參照)。
　　 3.30nmol/L IGFBPrP1 siRN

3、A(siRNA1、siRNA2)和陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，采用Western blot方法檢測(cè)HSC-T6中IGFBPrP1蛋白的表達(dá)(β-actin作為內(nèi)參照)。
　　 結(jié)果:
　　 1.10、30、50nmol/L的FAM-Negative siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)綠色熒光，對(duì)照組無(wú)熒光信號(hào)，30nmol/L和50nmol/L siRNA的轉(zhuǎn)染效率明顯高于10nmol/L組(P＜0.05)

4、；30nmol/L和50nmol/L siRNA組轉(zhuǎn)染效率無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但50nmol/L組細(xì)胞死亡嚴(yán)重，轉(zhuǎn)染效率約70％。
　　 2.30nmol/L IGFBPrP1 siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，siRNA1組HSC中IGFBPrP1基因的表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組和siRNA2組(P＜0.01)。
　　 3.30nmol/L IGFBPrP1 siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，siRNA1組HSC中

5、IGFBPrP1蛋白的表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組和siRNA2組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.化學(xué)合成的siRNA可以成功轉(zhuǎn)染HSC-T6，30nmol/L的siRNA即可獲得理想的轉(zhuǎn)染效果。
　　 2.化學(xué)合成的2對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T648h后，在mRNA水平和蛋白水平上，檢測(cè)結(jié)果一致，其中siRNA1抑制作用顯著。
　　 第二部分IGFBPrP1 siRNA對(duì)活化肝星狀細(xì)胞分泌細(xì)胞

6、外基質(zhì)的影響
　　 目的:利用化學(xué)合成的siRNA抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1(IGFBPrP1)基因的表達(dá)，研究其對(duì)肝星狀細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響。
　　 方法:選擇大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)作為研究對(duì)象，分別設(shè)立正常對(duì)照組(加入等量PBS)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染Negative siRNA control或FAM-Negative siRNA作對(duì)照)和IGFBPrP1 siRNA干擾組(將篩選的抑制效率

7、較高的siRNA以30nmol/L轉(zhuǎn)染HSC-T6)。siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T672h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液并抽提細(xì)胞胞漿蛋白，采用Westernblot檢測(cè)HSC-T6胞漿蛋白中IGFBPrP1和培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.Western blot檢測(cè)IGFBPrP1的表達(dá)：與正常對(duì)照組(0.42±0.03)和陰性對(duì)照組(0.40±0.03)相比，IGFBPrP1 siRNA

8、干擾組IGFBPrP1的相對(duì)蛋白表達(dá)量(0.21±0.04)顯著降低(F=48.018，P＜0.01)。
　　 2.Western blot檢測(cè)Ⅰ型膠原的表達(dá)：IGFBPrP1 siRNA干擾組Ⅰ型膠原的相對(duì)蛋白表達(dá)量(0.63±0.03)較正常對(duì)照組(0.61±0.03)和陰性對(duì)照組(0.35±0.05)顯著減少(F=81.246，P＜0.01)。
　　 3.Western blot檢測(cè)纖維連接蛋白的表達(dá)：干擾組纖維連

9、接蛋白的相對(duì)蛋白表達(dá)量(0.43±0.04)較正常對(duì)照組(0.76±0.07)和陰性對(duì)照組(0.74±0.05)明顯降低(F=43.850，P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.IGFBPrP1 siRNA能特異性抑制IGFBPrP1在HSC-T6中的表達(dá)。
　　 2.IGFBPrP1具有調(diào)節(jié)HSC-T6中CollagenⅠ和FN合成和分泌的功能，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化的形成。
　　 第三部分IGFBPrP

10、1與TGFB1關(guān)系初探
　　 目的:研究TGFβ1對(duì)HSC-T6中IGFBPrP1及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響；通過(guò)應(yīng)用siRNA阻斷HSC-T6中IGFBPrP1基因的表達(dá)，觀察TGFβ1對(duì)其的細(xì)胞外基質(zhì)的影響，以闡明IGFBPrP1在肝纖維化中的作用地位。
　　 方法:
　　 1.選擇大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)作為研究對(duì)象，分別設(shè)立正常對(duì)照組(加入等量PBS)和TGFβ1處理組(加入終濃度為4ng/ml的TG

11、Fβ1)。TGFβ1作用24h后，采用Western blot法檢測(cè)HSC-T6胞漿蛋白中IGFBPrP1和培養(yǎng)上清液中CollagenⅠ和FN表達(dá)的變化，并進(jìn)行IGFBPrP1與CollagenⅠ和FN的相關(guān)性分析。
　　 2.將大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)分為3組：陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染Negative siRNA control或FAM-Negative siRNA作對(duì)照)、siRNA干擾組(將篩選的抑制效率較高的siRNA

12、以30nmol/L轉(zhuǎn)染HSC-T6)和siRNA+TGFβ1組(將抑制效率較高的siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6，再加入TGFβ1刺激該HSC-T6)。TGFβ1作用24h后，采用Western blot法檢測(cè)HSC-T6胞漿蛋白中IGFBPrP1和培養(yǎng)上清液中TGFβ1、CollagenⅠ及FN表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.TGFβ1對(duì)HSC-T6中IGFBPrP1、CollagenⅠ和FN表達(dá)的影響：TGFβ1處理

13、組IGFBPrP1、CollagenⅠ和FN的相對(duì)蛋白表達(dá)量均較正常對(duì)照組顯著增加(IGFBPrP1：0.58±0.09 vs0.40±0.07，t=3.178，P＜0.05；CollagenⅠ：0.79±0.08 vs0.58±0.08，t=3.649，P＜0.05；FN：0.84±0.09 vs0.66±0.06，t=3.451，P＜0.05)。IGFBPrP1的表達(dá)變化與CollagenⅠ及FN的表達(dá)變化呈正相關(guān)(r值分別為0.7

14、87，0.814，P＜0.05)。
　　 2.IGFBPrP1 siRNA對(duì)TGFβ1刺激的HSC-T6中IGFBPrP1、CollagenⅠ、FN和TGFβ1表達(dá)的影響：siRNA干擾組IGFBPrP1、CollagenⅠ、FN和TGFβ1的相對(duì)蛋白表達(dá)量均較陰性對(duì)照組明顯降低(IGFBPrP1：0.22±0.06 vs0.40±0.03，F(xiàn)=19.384，P＜0.01；CollagenⅠ：0.36±0.12 vs0.61±0

15、.09，F(xiàn)=14.711，P＜0.05；FN：0.44±0.10 vs0.75±0.11，F(xiàn)=25.591，P＜0.05；TGFβ1：0.17±0.03 vs0.23±0.02，F(xiàn)=7.321，P＜0.05)；siRNA+TGFβ1組CollagenⅠ和FN的表達(dá)較陰性對(duì)照組(CollagenⅠ：0.79±0.12；FN:0.90±0.06)顯著增加(P＜0.05)，IGFBPrP1和TGFβ1的表達(dá)無(wú)明顯改變(P＞0.05)；siRN