Gremlin過表達增強大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)的活化.pdf

1、目的:克隆大鼠gremlin基因,研究gremlin高表達對體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細胞生長和活化的影響。本研究的目的是基于gremlin對大鼠肝星狀細胞活化影響的研究,初步了解認識gremlin在肝纖維化病變過程中的可能作用機制,為肝纖維化分子發(fā)病機制的研究提供一定的研究基礎(chǔ)。
　　方法:(1)Nest-RT-PCR克隆大鼠gremlin基因編碼區(qū),將其克隆入真核表達載體pcDNA3.1(+),構(gòu)建真核表達質(zhì)粒 pcDNA3.1(+

2、)/rgremlin。用pcDNA3.1(+)/rgremlin轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞,獲得穩(wěn)定高表達 gremlin的細胞株。(2)MTT法檢測高表達gremlin對HSC-T6細胞生長增殖的影響;流式細胞術(shù)檢測高表達gremlin對細胞周期的影響;細胞免疫熒光法檢測細胞內(nèi)gremlin和α-SMA表達;Western blotting檢測細胞內(nèi)α-SMA和膠原蛋白含量。(3)RT-PCR、Western blotting和熒光素酶報告

3、分析法檢測纖維化相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。
　　結(jié)果:(1)成功克隆大鼠gremlin基因編碼區(qū),構(gòu)建了gremlin真核表達質(zhì)粒,并獲得高表達gremlin的HSC-T6細胞株(19＃)。(2)MTT和流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與對照細胞相比較,高表達gremlin能抑制HSC-T6細胞的生長;Western blotting分析結(jié)果顯示,高表達gremlin能增強HSC-T6細胞的活化。(3)Western blotting檢測結(jié)果表明

4、,高表達 gremlin可增強TGF-β及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白p-smad2/3的表達,同時抑制smad7的表達;RT-PCR法檢測結(jié)果表明,高表達gremlin降低細胞內(nèi)BMP7信號分子的mRNA水平;熒光素酶報告分析和RT-PCR的結(jié)果顯示:高表達gremlin抑制星狀細胞內(nèi) NF-κB表達,另外還發(fā)現(xiàn),高表達gremlin后,HSC-T6細胞內(nèi)Notch1和Notch2的mRNA和蛋白質(zhì)水平均出現(xiàn)明顯下調(diào)。
　　結(jié)論:在gre