谷氨酰胺轉運體ASCT2在結直腸癌中的功能及調(diào)控機制研究.pdf

1、目的：
　　廣泛認為，異常的細胞代謝是腫瘤細胞的一個重要標志，并且許多腫瘤細胞表現(xiàn)出強烈的谷氨酰胺代謝依賴性。谷氨酰胺強烈依賴型的細胞表現(xiàn)出對大量的谷氨酰胺的攝取，它不僅為細胞核苷酸和氨基酸合成提供氮源，它還在其它氨基酸的攝取和mTOR通路的持續(xù)激活中起著重要的作用。此外，在許多腫瘤細胞中，谷氨酰胺是最重要的線粒體底物以維持線粒體膜的完整與穩(wěn)定，同時，它還為合成NADPH提供源料以維持細胞的氧化還原平衡。因此，谷氨酰胺代謝在腫瘤細

2、胞中的這些重要性也使它成為腫瘤診斷、監(jiān)測與治療的一個非常好的靶向窗口。
　　腫瘤細胞是通過上調(diào)一個或多個谷氨酰胺轉運體的表達來滿足其增加的谷氨酰胺需求，如果能夠?qū)⑦@些上調(diào)的谷氨酰胺轉運體鑒定出來，那么它們將成為抗腫瘤新藥研發(fā)的潛在靶點。ASCT2是目前報道最為詳盡且在許多腫瘤細胞中過表達的谷氨酰胺轉運體，然而，對于它的調(diào)控機制研究以及其臨床重要性報道較少。我們的研究目的是闡明ASCT2在結直腸癌中的臨床重要性、調(diào)控機制以及ASCT

3、2在腫瘤細胞中過表達的調(diào)控機制。
　　方法：
　　我們利用含有90對結腸癌患者的組織芯片進行免疫組化實驗及分析，代謝組學實驗用于分析ASCT2在谷氨酰胺代謝中的重要性。熒光素報告基因?qū)嶒炗糜阼b定miR-137對于ASCT2的直接作用。染色體免疫共沉淀實驗用于確定miR-137沉默的調(diào)控機制。慢病毒感染的結直腸癌細胞用于細胞增殖實驗以及小鼠移植癌實驗。所有的實驗來自于三次獨立的重復實驗的結果分析。
　　結果：
　　

4、為了確定ASCT2在結直腸癌中的臨床重要性，我們檢測了90對結直腸癌病人的腫瘤切片，發(fā)現(xiàn)ASCT2在結直腸癌中的表達量明顯高于所對應的正常結腸組織中的表達量。這一結果與其在其它腫瘤中如肺腺癌、前列腺癌、乳腺癌中結果一致。ASCT2的表達量并沒有隨結直腸癌的TNM分期呈現(xiàn)遞增的趨勢，且其表達量與結直腸癌患者的預后相關性并不明顯，這些結果說明ASCT2在腫瘤的起始階段較為重要。
　　基于以上結果，我們進一步評估了ASCT2在結直腸癌細

5、胞生長中重要性以及確定了它的一個新的調(diào)控機制。利用兩個特異性的shRNA將多株結直腸癌細胞中的ASCT2沉默后發(fā)現(xiàn)，與對照細胞相比，ASCT2沉默后的細胞株生長明顯減慢。通過PI染色發(fā)現(xiàn)，ASCT2沉默主要導致細胞周期中G1期的阻滯，與對照細胞相比，停留在DNA合成前期G1期的細胞數(shù)量增加，相應的處于DNA合成期的S期以及DNA合成后期的G2期減少，說明ASCT2沉默對細胞生長的抑制作用是通過細胞周期阻滯來完成的。機制方面，我們確定了A

6、SCT2是miR-137的一個直接靶點。瞬時的miR-137過表達可以導致ASCT2蛋白質(zhì)以及mRNA水平下調(diào)，而當細胞導入miR-137的抑制劑時，ASCT2的蛋白以及mRNA水平則會上調(diào)，這都說明了miR-137與ASCT2之間存在著聯(lián)系。并且，在不同腫瘤細胞中分別過表達miR-137，均能檢測到ASCT2水平的下降，說明這一調(diào)控機制的存在是廣譜的。接著，我們通過熒光素基因報告實驗證明了miR-137通過靶向ASCT2的3‘UTR區(qū)

7、域來行使其調(diào)控功能。miR-137的過表達能減弱帶有野生型ASCT23’UTR的熒光素表達值，而對于突變型ASCT23‘UTR的熒光素表達值幾乎無明顯影響，說明miR-137通過與ASCT23’UTR區(qū)域結合來負調(diào)控ASCT2，這一結果與大多數(shù)microRNA調(diào)控下游靶基因的原理一致。
　　為了闡明ASCT2在谷氨酰胺代謝中的重要性，我們利用代謝組學實驗分析了ASCT2沉默之后代謝產(chǎn)物與對照代謝產(chǎn)物表達量的差異。我們發(fā)現(xiàn)，ASCT

8、2的沉默廣泛減少了三羧酸循環(huán)產(chǎn)物生成、非必需氨基酸、脂類以及核苷酸的合成，而導致葡萄糖以及果糖等在細胞中大量堆積。這些結果都反映了，ASCT2的沉默會導致細胞代謝的癱瘓。同時，我們也檢測了miR-137過表達之后細胞的代謝水平，發(fā)現(xiàn)miR-137過表達對細胞谷氨酰胺代謝的影響與ASCT2沉默后的結果一致，說明miR-137是通過調(diào)控ASCT2來對谷氨酰胺代謝產(chǎn)生影響的。
　　由于結直腸癌的一個重要特征是廣泛的miRNA下調(diào)，其中就

9、包括miR-137，這激起了我們對于其下調(diào)機制研究的興趣。染色體免疫共沉淀實驗反映了MeCP2和DNMT3B選擇性地結合于之前所報道的miR-137甲基化的啟動子區(qū)域。接著，我們分別用DNMT3B的抑制劑Decitabine和MeCP2的shRNA去處理HCT116細胞，發(fā)現(xiàn)處理后的細胞中miR-137的水平升高了，相應地ASCT2的蛋白水平下降了。同時，我們對于這兩種處理后的細胞進行了染色體免疫共沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)與未處理的對照細胞相比，

10、無論是用Decitabine處理的細胞還是導入shMeCP2的細胞，DNMT3B與MeCP2在miR-137對應的啟動子區(qū)域的結合率都下降了。這都充分說明了DNMT3B和MeCP2介導了miR-137的甲基化沉默。MiR-137沉默機制的發(fā)現(xiàn)從側面證明了ASCT2在結直腸癌中過表達的原因。
　　最后，我們在12對結直腸癌腫瘤組織及癌旁正常組織中確認了miR-137與ASCT2之間的負相關性，這一結果與細胞中兩者的負相關性一致。此外